13.1. Reaksionet antigjen-antitrup dhe aplikimet e tyre

Kur futet një antigjen, në trup formohen antitrupa. Antitrupat janë plotësues të antigjenit që shkaktoi sintezën e tyre dhe janë në gjendje të lidhen me të. Lidhja e antigjeneve me antitrupat përbëhet nga dy faza. Faza e parë është specifike, në të cilën ndodh lidhja e shpejtë e përcaktuesit antigjenik me qendrën aktive të fragmentit Fab të antitrupave. Duhet të theksohet se lidhja është për shkak të forcave van der Waals, hidrogjenit dhe ndërveprimeve hidrofobike. Forca e lidhjes përcaktohet nga shkalla e korrespondencës hapësinore midis vendit aktiv të antitrupit dhe epitopit të antigjenit. Pas fazës specifike, fillon një fazë më e ngadaltë - jo specifike, e cila manifestohet nga një fenomen fizik i dukshëm (për shembull, formimi i thekoneve gjatë aglutinimit, etj.).

Reaksionet imune janë ndërveprime ndërmjet antitrupave dhe antigjeneve, dhe këto reagime janë specifike dhe shumë të ndjeshme. Ato përdoren gjerësisht në praktikën mjekësore. Me ndihmën e reaksioneve imune, problemet e mëposhtme mund të zgjidhen:

Përcaktimi i antitrupave të panjohur nga antigjenet e njohur (antigenic diagnosticum). Kjo detyrë ndodh kur është e nevojshme të përcaktohen antitrupat ndaj një patogjeni në serumin e gjakut të pacientit (serodiagnoza). Gjetja e antitrupave ju lejon të konfirmoni diagnozën;

Përcaktimi i antigjeneve të panjohur duke përdorur antitrupa të njohur (serum diagnostik). Ky studim kryhet kur identifikohet një kulturë patogjene e izoluar nga materiali i pacientit (serotipizimi), si dhe kur zbulohet

antigjenet mikrobiale dhe toksinat e tyre në gjak dhe lëngje të tjera biologjike. Ka shumë lloje të reaksioneve imune, të ndryshme në teknikën e skenimit dhe efektin e regjistruar. Këto janë reaksionet e aglutinimit (RA), reaksionet e precipitimit (RP), reaksionet që përfshijnë komplementin (RSC), reaksionet që përdorin përbërës të etiketuar (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Reaksioni i aglutinimit

Një reaksion aglutinimi (RA) është një reaksion imunitar i ndërveprimit të një antigjeni me antitrupat në prani të elektroliteve, dhe antigjeni është në një gjendje korpuskulare (qelizat e kuqe të gjakut, bakteret, grimcat e lateksit me antigjenet e adsorbuar). Gjatë aglutinimit, antigjenet korpuskulare janë ngjitur së bashku nga antitrupat, gjë që manifestohet me formimin e një precipitati flokulent. Formimi i thekoneve ndodh për faktin se antitrupat kanë dy qendra aktive, dhe antigjenet janë polivalente, d.m.th. kanë disa përcaktues antigjenikë. RA përdoret për të identifikuar patogjenin e izoluar nga materiali i pacientit, si dhe për të zbuluar antitrupat ndaj patogjenit në serumin e gjakut të pacientit (për shembull, reaksionet Wright dhe Heddleson për brucelozën, reaksioni Widal për ethet tifoide dhe ethet paratifoide).

Mënyra më e thjeshtë për të diagnostikuar RA është reagimi në xhami, ky është një RA i përafërt, i cili përdoret për të përcaktuar patogjenin e izoluar nga pacienti. Kur vendoset një reaksion, serumi diagnostikues aglutinues aplikohet në një rrëshqitje qelqi (në një hollim prej 1:10 ose 1:20), pastaj shtohet një kulturë nga pacienti. Reagimi është pozitiv nëse në rënie shfaqet një sediment flokulent. Një kontroll vendoset afër: në vend të serumit, aplikohet një pikë tretësirë ​​e klorurit të natriumit. Nëse serumi diagnostikues aglutinues nuk absorbohet 1, atëherë ai hollohet (në titrin - hollimi në të cilin duhet të ndodhë aglutinimi), d.m.th. vendos RA të zgjeruar në epruveta me rritje

1 Serumi aglutinues i paadsorbuar mund të aglutinojë bakteret e lidhura që kanë antigjene të përbashkëta (reaguese të kryqëzuara). Prandaj përdorinserum aglutinues të absorbuar, nga të cilat janë hequr antitrupat me reaksion të kryqëzuar me anë të adsorbimit në bakteret përkatëse. Serumet e tilla ruajnë antitrupa që janë specifikë vetëm për një bakter të caktuar.

hollimet e serumit aglutinues, të cilit i shtohen 2-3 pika të një suspensioni të patogjenit të izoluar nga pacienti. Aglutinimi merret parasysh nga sasia e sedimentit dhe shkalla e pastrimit të lëngut në provëza. Reagimi konsiderohet pozitiv nëse aglutinimi vërehet në një hollim afër titrit të serumit diagnostik. Reagimi shoqërohet me kontrolle: serumi i holluar me tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit duhet të jetë transparent, suspensioni i mikrobeve në të njëjtën tretësirë ​​duhet të jetë uniformisht i turbullt, pa sediment.

Për të përcaktuar antitrupat ndaj patogjenit në serumin e gjakut të pacientit, përdoret RA në shkallë të plotë. Kur vendoset, serumi i gjakut i pacientit hollohet në epruveta dhe një sasi e barabartë e suspensionit diagnostik (pezullimi i mikrobeve të vrarë) shtohet në provëza. Pas inkubacionit, përcaktohet hollimi më i lartë i serumit në të cilin ka ndodhur aglutinimi, d.m.th. është formuar një precipitat (titri i serumit). Në këtë rast, reaksioni i aglutinimit me O-diagnosticum (bakteret e vrarë nga ngrohja, që mbajnë O-antigjenin termostabil) ndodh në formën e aglutinimit me kokrriza të imta. Reaksioni i aglutinimit me H-diagnosticum (bakteret e vrarë nga formaldehidi, që mbajnë antigjenin H-flagjelar termolabil) është i trashë dhe vazhdon më shpejt.

Reaksioni indirekt (pasiv) i hemaglutinimit(RNGA ose RPGA) është një lloj RA. Kjo metodë është shumë e ndjeshme. Me ndihmën e RNGA-së mund të zgjidhen dy probleme: të përcaktohen antitrupat në serumin e gjakut të pacientit, të cilit i shtohet një eritrociti antigjenik diagnosticum, që janë eritrocite mbi të cilat adsorbohen antigjenet e njohura; të përcaktojë praninë e antigjeneve në materialin e provës. Në këtë rast, reaksioni nganjëherë quhet reaksioni i kundërt i hemaglutinimit indirekt (RONHA). Gjatë procedurës, materialit testues i shtohet një diagnostifikim i eritrociteve me antitrupa (eritrocite me antitrupa të përthithur në sipërfaqen e tyre). Në këtë reagim, qelizat e kuqe të gjakut veprojnë si bartës dhe përfshihen në mënyrë pasive në formimin e agregateve imune. Me një reagim pozitiv, qelizat e kuqe të gjakut të ngjitura në mënyrë pasive mbulojnë pjesën e poshtme të vrimës në një shtresë të barabartë me skaje të gërvishtura ("ombrellë"); në mungesë të aglutinimit, qelizat e kuqe të gjakut grumbullohen në zgavrën qendrore të vrimës, duke formuar një "buton" kompakt me skaje të përcaktuara ashpër.

Reaksioni i koaglutinimit përdoret për të përcaktuar qelizat patogjene (antigjenet) duke përdorur antitrupa të adsorbuar në Staphylococcus aureus, që përmban proteinën A. Proteina A ka një afinitet për fragmentin Fc të imunoglobulinave. Falë kësaj, antitrupat lidhen me stafilokokun në mënyrë indirekte përmes fragmentit Fc, dhe fragmentet Fab janë të orientuara nga jashtë dhe janë në gjendje të ndërveprojnë me mikrobet përkatëse të izoluara nga pacientët. Në këtë rast, formohen thekon.

Reaksioni i frenimit të hemaglutinimit (HAI) përdoret në diagnostikimin e infeksioneve virale, dhe vetëm infeksionet e shkaktuara nga viruset hemaglutinuese. Këto viruse përmbajnë një proteinë në sipërfaqen e tyre - hemagglutinin, e cila është përgjegjëse për reaksionin e hemaglutinimit (HRA) kur qelizat e kuqe të gjakut u shtohen viruseve. RTGA përfshin bllokimin e antigjeneve virale me antitrupa, si rezultat i të cilave viruset humbasin aftësinë e tyre për të aglutinuar qelizat e kuqe të gjakut.

Reagimi Coombs - RA për përcaktimin e antitrupave jo të plotë. Në disa sëmundje infektive, si bruceloza, antitrupat jo të plotë ndaj patogjenit qarkullojnë në serumin e gjakut të pacientit. Antitrupat jo të plotë quhen antitrupa bllokues sepse kanë një vend lidhës antigjen, dhe jo dy, si antitrupat e plotë. Prandaj, kur shtohet një diagnozë antigjenike, antitrupat jo të plotë lidhen me antigjenet, por nuk i ngjitin ato së bashku. Për të manifestuar reaksionin, shtohet serumi antiglobulin (antitrupa ndaj imunoglobulinave njerëzore), i cili do të çojë në aglutinimin e komplekseve imune (antigjenike diagnosticum + antitrupa jo të plota) të formuara në fazën e parë të reaksionit.

Reaksioni indirekt Coombs përdoret në pacientët me hemolizë intravaskulare. Në disa prej këtyre pacientëve, zbulohen antitrupa jo të plota monovalente anti-Rhesus. Ato ndërveprojnë në mënyrë specifike me eritrocitet Rh-pozitive, por nuk shkaktojnë aglutinimin e tyre. Prandaj, serumi antiglobulin i shtohet sistemit të antitrupave anti-Rh + eritrociteve Rh-pozitive, gjë që shkakton aglutinimin e eritrociteve. Duke përdorur reaksionin Coombs, diagnostikohen kushtet patologjike të lidhura me lizën intravaskulare të eritrociteve me origjinë imune, për shembull, sëmundja hemolitike e të porsalindurit e shkaktuar nga konflikti Rh.

RA për përcaktimin e grupeve të gjakut bazohet në aglutinimin e eritrociteve nga antitrupat imun të serumit ndaj antigjeneve të grupit të gjakut A(II), B(III). Kontrolli është serumi që nuk përmban antitrupa, d.m.th. grupi i gjakut AB(IV) i serumit dhe antigjenet e eritrociteve te grupeve A(P) dhe B(III). Qelizat e kuqe të gjakut të grupit 0(I) përdoren si kontroll negativ sepse nuk kanë antigjene.

Për të përcaktuar faktorin Rh, përdoren serume anti-Rh (të paktën dy seri të ndryshme). Nëse ka një antigjen Rh në membranën e eritrociteve në studim, ndodh aglutinimi i këtyre qelizave.

13.3. Reagimi i reshjeve

RP është një reaksion imunitar i ndërveprimit të antitrupave me antigjenet në prani të elektroliteve, dhe antigjeni është në gjendje të tretshme. Gjatë precipitimit, antigjenet e tretshëm precipitohen nga antitrupat, gjë që manifestohet me vranësira në formën e brezave të precipitimit. Formimi i një precipitati të dukshëm vërehet kur të dy reagentët përzihen në raporte ekuivalente. Një tepricë e njërit prej tyre zvogëlon numrin e komplekseve imune të precipituara. Ka mënyra të ndryshme për të kryer reaksionin e reshjeve.

Reaksioni i reshjeve të unazës të vendosura në tuba reshjesh me diametër të vogël. Serumi imunitar shtohet në epruvetë dhe antigjeni i tretshëm shtresohet me kujdes. Nëse rezultati është pozitiv, një unazë qumështi formohet në ndërfaqen e dy solucioneve. Reaksioni i precipitimit unazor, i cili përdoret për të përcaktuar praninë e antigjeneve në organe dhe inde, ekstraktet e të cilave zihen dhe filthen, quhet reaksioni i termoprecipitimit (reaksioni Ascoli për përcaktimin e antigjenit të antraksit termostabil).

Reagimi i imunodifuzionit të dyfishtë Ouchterlony. Ky reagim kryhet në një xhel agar. Në një shtresë xheli me trashësi uniforme, puset priten në një distancë të caktuar nga njëra-tjetra dhe mbushen përkatësisht me antigjen dhe serum imunitar. Pas kësaj, antigjenet dhe antitrupat shpërndahen në xhel, takohen me njëri-tjetrin dhe formojnë komplekse imune, të cilat precipitojnë në xhel dhe bëhen të dukshme si vija precize.

të ushqyerit. Ky reagim mund të përdoret për të identifikuar antigjene ose antitrupa të panjohur, si dhe për të testuar ngjashmërinë midis antigjeneve të ndryshëm: nëse antigjenet janë identikë, linjat e precipitimit bashkohen, nëse antigjenet nuk janë identike, linjat e precipitimit kryqëzohen, nëse antigjenet janë pjesërisht. identike, formohet një nxitje.

Reagimi i imunodifuzionit radial. Antitrupat i shtohen xhelit të shkrirë të agarit dhe xheli aplikohet në një shtresë të barabartë në gotë. Puset priten në xhel dhe atyre u shtohet një vëllim standard i zgjidhjeve të antigjenit me përqendrime të ndryshme. Gjatë inkubacionit, antigjenet shpërndahen në mënyrë radiale nga pusi dhe, duke takuar antitrupat, formojnë një unazë precipitimi. Për sa kohë që antigjeni i tepërt mbetet në pus, ndodh një rritje graduale në diametrin e unazës së reshjeve. Kjo metodë përdoret për të përcaktuar antigjenet ose antitrupat në tretësirën e provës (për shembull, për të përcaktuar përqendrimin e imunoglobulinave të klasave të ndryshme në serumin e gjakut).

Imunoelektroforeza. Përzierja e antigjenit fillimisht ndahet elektroforetikisht, më pas antiserumi precipitues shtohet në brazdë që shkon përgjatë drejtimit të lëvizjes së proteinave. Antigjenet dhe antitrupat shpërndahen në xhel drejt njëri-tjetrit; duke ndërvepruar, ato formojnë linja harkore të reshjeve.

Reaksioni i flokulimit(sipas Ramon) - një lloj reaksioni i precipitimit që përdoret për të përcaktuar aktivitetin e serumit ose toksoidit antitoksik. Reagimi kryhet në epruveta. Në një provëz ku toksoidi dhe antitoksina janë në një raport të barabartë, vërehet turbullira.

13.4. Reaksioni i fiksimit të komplementit

Antitrupat, duke ndërvepruar me antigjenin përkatës, lidhin komplementin e shtuar (sistemi i parë). Një tregues i fiksimit të komplementit janë eritrocitet e sensibilizuara me serum hemolitik, d.m.th. antitrupa ndaj qelizave të kuqe të gjakut (sistemi i dytë). Nëse komplementi nuk është i fiksuar në sistemin e parë, d.m.th. Nëse reaksioni antigjen-antitrup nuk ndodh, qelizat e kuqe të sensibilizuara lizohen plotësisht (reaksion negativ). Kur komplementi fiksohet nga komplekset imune të sistemit të parë pas shtimit të eritrociteve të sensibilizuara, hemoliza nga

mungon (reagim pozitiv). Reaksioni i fiksimit të komplementit përdoret për të diagnostikuar sëmundjet infektive (gonorea, sifilizi, gripi, etj.).

13.5. Reagimi i neutralizimit

Mikrobet dhe toksinat e tyre kanë një efekt të dëmshëm në organet dhe indet e trupit të njeriut. Antitrupat janë në gjendje të lidhen me këta agjentë dëmtues dhe t'i bllokojnë ato, d.m.th. neutralizoj. Reagimi diagnostik i neutralizimit bazohet në këtë veçori të antitrupave. Ajo kryhet duke futur një përzierje antigjen-antitrup në kafshë ose në objekte testuese të ndjeshme (kultura qelizore, embrione). Për shembull, për të zbuluar toksina në materialin e pacientit, kafshëve të grupit të parë u injektohet material nga pacienti. Kafshëve të grupit të dytë u injektohet material i ngjashëm, i para-trajtuar me antiserumin përkatës. Kafshët e grupit 1 ngordhin nëse ka një toksinë në material. Grupi i dytë i kafshëve mbijeton, efekti dëmtues i toksinës nuk shfaqet, pasi ajo neutralizohet.

13.6. Reaksionet duke përdorur antitrupa ose antigjenë të etiketuar

13.6.1. Reagimi i imunofluoreshencës (RIF, metoda Koons)

Kjo metodë përdoret për diagnostikim të shprehur. Mund të përdoret për të zbuluar si antigjenet mikrobike ashtu edhe antitrupat.

Metoda e drejtpërdrejtë RIF- një reaksion imunitar i ndërveprimit të antitrupave me antigjenet, dhe antitrupat janë etiketuar me një fluorokrom - një substancë e aftë të lëshojë kuanta të lehta të një gjatësi vale të caktuar kur ekspozohet ndaj dritës së një gjatësi vale të caktuar. E veçanta e kësaj metode është nevoja për të hequr përbërësit që nuk kanë reaguar në mënyrë që të përjashtohet zbulimi i lumineshencës jospecifike. Për ta bërë këtë, lani antitrupat që nuk kanë reaguar. Rezultatet vlerësohen duke përdorur një mikroskop fluoreshent. Bakteret në një njollë të trajtuar me një serum të tillë ndriçues shkëlqejnë në një sfond të errët përgjatë periferisë së qelizës.

Metoda indirekte RIF përdoret më shpesh se ai i mëparshmi. Ky reagim kryhet në dy faza. Në fazën e parë, antigjenet ndërveprojnë

ndërveprojnë me antitrupat përkatës, duke formuar komplekse imune. Të gjithë përbërësit që nuk kanë reaguar (d.m.th., nuk janë pjesë e komplekseve imune) duhet të hiqen me larje. Në fazën e dytë, kompleksi antigjen-antitrup që rezulton zbulohet duke përdorur serumin antiglobulin të fluorokromizuar. Si rezultat, formohet një kompleks i mikrobeve + antitrupave antimikrobikë të lepurit + antitrupave ndaj imunoglobulinave të lepurit, të etiketuara me fluorokrom. Rezultatet vlerësohen duke përdorur një mikroskop fluoreshent.

13.6.2. Metoda ose analiza e imuno-analizimit enzimë

ELISA është metoda moderne më e zakonshme që përdoret për diagnostikimin e infeksioneve virale, bakteriale, protozoale, veçanërisht për diagnostikimin e infeksionit HIV, hepatitit viral etj.

Ka shumë modifikime ELISA. ELISA jo konkurruese e fazës së ngurtë përdoret gjerësisht. Ai realizohet në pllaka polistiren 96 pusesh (faza e ngurtë). Gjatë kryerjes së një reaksioni, është e nevojshme të lani përbërësit që nuk kanë reaguar në çdo fazë. Gjatë përcaktimit të antitrupave, serumi i gjakut i testuar shtohet në puset në të cilat thithen antigjenet, pastaj serumi antiglobulin i etiketuar me një enzimë. Reaksioni kryhet duke shtuar një substrat për enzimën. Në prani të një enzime, substrati ndryshon dhe kompleksi enzimë-substrat zgjidhet në mënyrë që produkti i formuar në reaksion të ngjyroset. Kështu, me një reagim pozitiv, vërehet një ndryshim në ngjyrën e tretësirës. Për të përcaktuar antigjenet, bartësi i fazës së ngurtë sensibilizohet me antitrupa, pastaj materiali i testimit (antigjenet) dhe serumi i etiketuar me enzimë i shtohen antigjeneve në mënyrë sekuenciale. Që të ndodhë reaksioni, shtohet një substrat për enzimën. Një ndryshim në ngjyrën e tretësirës ndodh me një reagim pozitiv.

13.6.3. Imunoblotting

Kjo metodë bazohet në një kombinim të elektroforezës dhe ELISA. Kur kryeni imunoblotting (blotting nga anglishtja. njollë- spot) një përzierje komplekse antigjenesh i nënshtrohet fillimisht elektroforezës në një xhel poliakrilamid. Rezultati i fraksionuar anti-

peptidet e gjeneve transferohen në një membranë nitroceluloze. Njollat ​​trajtohen më pas me antitrupa të etiketuara me enzimë ndaj një antigjeni specifik, d.m.th. kryeni blotin ELISA. Imunoblotting përdoret në diagnostikimin e infeksioneve të tilla si HIV.

13.6.4. Mikroskopi elektronik imunitar

Metoda përfshin mikroskopimin e viruseve (më rrallë mikrobe të tjera) në një mikroskop elektronik, të para-trajtuar me serumin e duhur imunitar të etiketuar me preparate të dendura elektron-optikisht, për shembull ferritin, një proteinë që përmban hekur.

13.7. Rrjedhin cytometry

Qelizat e gjakut diferencohen në bazë të citofluorometrisë lazer. Për ta bërë këtë, qelizat e dëshiruara ngjyrosen me antitrupa monoklonale fluoreshente ndaj antigjeneve CD. Mostra e gjakut, pasi trajtohet me antitrupa të etiketuar, kalohet përmes një tubi të hollë dhe përmes tij kalon një rreze lazer, e cila eksiton fluorokromin të shkëlqejë. Intensiteti i fluoreshencës lidhet me densitetin e antigjeneve në sipërfaqen e qelizës dhe mund të matet në mënyrë sasiore duke përdorur një tub fotoshumëzues. Rezultatet e marra shndërrohen në një histogram.

Citometria e rrjedhës përdoret për të përcaktuar statusin imunitar (përmbajtja e popullatave kryesore të limfociteve, përmbajtja e citokineve ndërqelizore dhe jashtëqelizore, aktiviteti funksional i qelizave NK, aktiviteti i fagocitozës, etj.).

Aglutinimi është ngjitja dhe precipitimi i mikrobeve ose qelizave të tjera nën ndikimin e antitrupave në prani të një elektroliti (solucion izotonik i klorurit të natriumit). Grupet e baktereve (qelizave) të ngjitura quhen aglutinate. Për reaksionin e aglutinimit kërkohen komponentët e mëposhtëm:

1. Antitrupat (aglutinina) që gjenden në serumin e një kafshe të sëmurë ose imune.

2. Antigjen - një pezullim i mikrobeve të gjalla ose të vrarë, rruazave të kuqe të gjakut ose qelizave të tjera.

3. Tretësirë ​​izotonike (0,9%) klorur natriumi.

Reaksioni i aglutinimit për serodiagnozë përdoret për ethet tifoide dhe paratifoide (reagimi Vidal), bruceloza (reaksioni Wright dhe Heddleson), tularemia etj. Antitrupi është serumi i pacientit dhe antigjeni është një mikrob i njohur. Kur identifikohen mikrobet ose qelizat e tjera, pezullimi i tyre përdoret si antigjen dhe një serum i njohur imunitar përdoret si antitrup. Ky reagim përdoret gjerësisht për të diagnostikuar infeksionet e zorrëve, kollën e mirë etj.

Metodat për stadifikimin e RA

RA e përafërt në xhami

RA e vendosur

(metoda e volumit)

Reaksioni i koaglutinimit

RA e shpalosur në xhami (seroidentifikimi)

Reagimi i aglutinimit në xhami. Dy pika serum specifik (të përthithur) dhe një pikë solucioni izotonik i klorurit të natriumit aplikohen në një rrëshqitje qelqi pa yndyrë. Serumet e pa absorbuar para-hollohen në një raport 1:5 - 1:100. Pikat duhet të aplikohen në gotë në mënyrë që të ketë një distancë midis tyre. Kultura bluhet tërësisht në gotë me një lak ose pipetë dhe më pas shtohet në një pikë tretësirë ​​izotonike të klorurit të natriumit dhe në njërën nga pikat e serumit, duke e përzier secilën derisa të formohet një suspension homogjen. Një pikë serumi pa kulturë është një kontroll i serumit.

Kujdes! Ju nuk mund ta transferoni kulturën nga serumi në një pikë solucioni izotonik të klorurit të natriumit, i cili shërben si një kontroll antigjen. Reagimi zhvillohet në temperaturën e dhomës për 1-3 minuta. Nëse kontrolli i serumit mbetet transparent, vërehet një turbullirë uniforme në kontrollin e antigjenit dhe thekon aglutinate shfaqen në pikën ku kultura përzihet me serumin në sfondin e një lëngu të pastër, rezultati i reagimit konsiderohet pozitiv.

Diagnostifikimi Fiziologjik

serum + tretje kulture + kulture

Reaksioni i detajuar i aglutinimit (metoda e volumit). Përgatiten hollime serike, më së shpeshti të dyfishta, të serumit. Metoda quhet vëllimore. Për të përcaktuar titrin e antitrupave në serumin e gjakut, merrni 6 tuba. Hidhni 1 ml të hollimit origjinal të serumit 1:50 në epruvetën e parë dhe shtoni 1 ml tretësirë ​​të kripur në të 6 epruvetat duke përdorur një pipetë të shkallëzuar. Provëza e parë do të japë një hollim serumi prej 1:100 me një vëllim prej 2 ml. Transferoni 1 ml nga provëza e parë në epruvetën e dytë, ku hollimi bëhet 1:200. Pra, bëni një sërë hollimesh serike të serumit në 5 epruvetat e para (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Nga epruveta e pestë hidhni 1 ml në tretësirën dezinfektuese. Shtoni 2 pika diagnozë në të 6 epruvetat. Tubi i gjashtë është një kontroll kulture, pasi përmban vetëm tretësirë ​​të kripur dhe diagnostifikim.

Një kontroll i tillë është i nevojshëm për të përjashtuar aglutinimin spontan të kulturës. Tubat tunden dhe vendosen në një termostat në temperaturën 37°C për 2 orë dhe më pas lihen një ditë në temperaturën e dhomës, pas së cilës regjistrohen rezultatet e reaksionit të aglutinimit. Gjatë kryerjes së një reaksioni aglutinimi me serumet e fëmijëve në muajt e parë të jetës, për shkak të inferioritetit funksional të formimit të antitrupave, është e nevojshme të identifikohen titrat më të ulët të antitrupave, gjë që merret parasysh gjatë hollimit të serumit. Hollimi fillestar i serumit është 1:25. Në epruvetën e parë fitohet hollimi 1:50, më pas 1:100 etj.

Nëse rezultati i reagimit është pozitiv, epruvetat tregojnë qeliza të mbërthyera në formën e kokrrave ose thekoneve në sfondin e një lëngu të pastër. Aglutinati gradualisht vendoset në fund në formën e një "ombrelle" dhe lëngu sipër sedimentit bëhet i qartë. Kontrolli i antigjenit është uniformisht i turbullt.

Në bazë të natyrës së sedimentit, dallohet aglutinimi me kokrriza të imta dhe të trashë (krisore). Aglutinimi me kokrriza të imta fitohet gjatë punës me O-sera. Kokrra e trashë - kur mikrobet lëvizëse ndërveprojnë me serumet H flagjelare. Ndodh më shpejt se kokrriza e imët, dhe sedimenti që rezulton është shumë i lirshëm dhe thyhet lehtësisht.

Intensiteti i reagimit shprehet si më poshtë:

Të gjitha qelizat janë vendosur, lëngu në epruvetë është plotësisht transparent. Rezultati i reagimit është ashpër pozitiv;

Ka më pak sediment, lëngu nuk pastrohet plotësisht. Rezultati i reagimit është pozitiv;

Ka edhe më pak sediment, lëngu është më i turbullt. Rezultati i reagimit është i dyshimtë;

Ka një sediment të lehtë në fund të epruvetës, lëngu është i turbullt. Rezultati i dyshimtë i reagimit;

Nuk ka sediment, lëngu është uniformisht i turbullt, si në kontrollin e antigjenit. Rezultati i reagimit negativ

Tabela e përmbajtjes së temës "Imunomoduluesit. Imunodiagnoza e sëmundjeve infektive.":

Reagimi i detajuar i aglutinimit (RA). Për të përcaktuar AT në serumin e gjakut të pacientit, a reaksioni i gjerë i aglutinimit (RA). Për ta bërë këtë, një sërë hollimesh të serumit të gjakut i shtohet një diagnozë - një pezullim i mikroorganizmave të vrarë ose grimcave me Ag të sorbuar. Dhënia maksimale e hollimit aglutinimi Ag quhet titri i serumit.

Llojet e reaksionit të aglutinimit (RA) për të identifikuar AT - një test me pika gjaku për tulareminë (me një diagnozë të aplikuar në një pikë gjaku dhe shfaqjen e aglutinateve të dukshme të bardha) dhe testin Huddleson për brucelozë (me një diagnozë të njollosur me violet gentian të aplikuar në një pikë gjaku serum).

Reaksioni i përafërt i aglutinimit (RA)

Për të identifikuar mikroorganizmat e izoluar, një RA e përafërt vendoset në rrëshqitjet e qelqit. Për ta bërë këtë, një kulturë patogjene i shtohet një pikë antiserumi diagnostikues standard (holluar 1:10, 1:20). Nëse rezultati është pozitiv, kryhet një reagim i detajuar me hollime në rritje të antiserumit.

Reagimi konsiderohet pozitive nëse vërehet aglutinim në hollime afër titrit të serumit diagnostik.

OAS. Somatike O-Ags janë të qëndrueshme ndaj nxehtësisë dhe mund t'i rezistojnë zierjes për 2 orë Kur ndërveprojnë me AT, ato formojnë agregate të imët.

N-Ag. N-Ag (flagjelat) janë termolabile dhe degradohen shpejt në 100 °C, si dhe nën ndikimin e etanolit. Në reaksionet me H-antiserum, pas 2 orësh inkubimi, formohen thekon të mëdha të lirshme (të formuara nga bakteret që ngjiten së bashku me flagjelat).

Vi-Ar bakteret tifoide janë relativisht të qëndrueshme ndaj nxehtësisë (i rezistojnë temperaturave 60-62 °C për 2 orë); Kur inkubohet me antiserum Vi, formohet një aglutinat me kokërr të imët.

Reaksionet e drejtpërdrejta të hemaglutinimit

Më e thjeshta nga këto reagimet - aglutinimi qelizat e kuqe të gjakut, ose hemaglutinimi, që përdoren për të përcaktuar grupet e gjakut në sistemin ABO. Për përcaktimin aglutinimi(ose mungesa e tij) përdorni antisera standarde me aglutinina anti-A dhe anti-B. Reagimi quhet i drejtpërdrejtë, pasi Ags që studiohen janë përbërës natyralë të qelizave të kuqe të gjakut.

E zakonshme me hemaglutinimi i drejtpërdrejtë hemaglutinimi viral ka mekanizma. Shumë viruse janë në gjendje të aglutinojnë spontanisht eritrocitet e shpendëve dhe gjitarëve, shtimi i tyre në një pezullim të eritrociteve shkakton formimin e agregateve prej tyre.

Synimi: Të zotërojë teknikën e kryerjes së reaksioneve të aglutinimit dhe reaksioneve të precipitimit për diagnostikimin e sëmundjeve infektive.

Moduli 1. Morfologjia dhe fiziologjia e mikroorganizmave. Infeksioni. Imuniteti.

Tema 16: Reaksioni i aglutinimit. Reagimi i reshjeve.

Rëndësia e temës. Nën imuniteti nënkuptojnë imunitetin e trupit ndaj agjentëve infektivë dhe joinfektivë (mikroorganizma patogjenë, proteina të huaja dhe substanca të tjera). Këta agjentë quhen antigjenë. Imuniteti mund të jetë i lindur ose i fituar. Kongjenitale– kur krijohen mjete mbrojtëse indore dhe humorale, duke shkaktuar imunitet ndaj sëmundjeve infektive të transmetuara nga trashëgimia.

I fituar– kryhet nga sistemi imunitar i trupit në formën e prodhimit të antitrupave ose akumulimit të limfociteve të sensibilizuara. Ajo është e ndarë në natyrore dhe artificiale. Sipas mekanizmit të veprimit ndahet në aktive dhe pasive. Në të gjitha reaksionet imunologjike, përbërësi kryesor është antigjeni.

Funksioni kryesor i sistemit imunitar, i cili përbëhet nga indet limfoide, është njohja e agjentëve të huaj (antigjenet) dhe neutralizimi i tyre.

Antigjenet mund të hyjnë në trup përmes traktit respirator, traktit tretës dhe përmes lëkurës dhe mukozave. Çdo antigjen stimulon formimin e substancave të veçanta proteinike - antitrupa.

Antigjenet ndahen në të plota dhe inferiore (haptens). Antigjene të plota nxisin një përgjigje të plotë imune. Antigjenet me defekt Ata nuk nxisin vetë një përgjigje imune, por ndonjëherë e fitojnë këtë aftësi kur bashkohen me bartës të proteinave me peshë të lartë molekulare. Përveç kësaj, ekzistojnë antigjene: hemihaptens, proantigjene, heteroantigjene dhe izoantigjene.

Antitrupat janë imunoglobulina nga serumi i gjakut të njeriut ose të kafshëve. Antitrupat formohen pas një infeksioni dhe si rezultat i imunizimit me baktere të dobësuara ose të vrarë, rikeci, viruse, toksina dhe agjentë të tjerë. Antitrupat– Proteinat e imunoglobulinave klasifikohen si glikoproteina në përbërjen kimike. Në bazë të strukturës dhe vetive imunobiologjike, imunoglobulinat ndahen në 5 klasa: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Antitrupat normalë gjendet tek njerëzit dhe kafshët që nuk janë të imunizuara. Antitrupa specifikë e formuar si rezultat i infeksionit ose imunizimit.

Reagimi midis një antitrupi dhe një antigjeni quhet serologjike. Testet serologjike janë shumë specifike dhe përdoren në diagnostikimin e shumë sëmundjeve infektive. Bëhet dallimi midis reaksioneve të aglutinimit dhe precipitimit.

1. Reaksioni i aglutinimit (RA) bazohet në ndërveprimin e një antigjeni (aglutinogen) dhe një antitrupi (agglutinin), në të cilin trupat mikrobikë ngjiten së bashku dhe precipitojnë në prani të një elektroliti. Ekzistojnë modifikime të ndryshme të reaksionit të aglutinimit.

Më të rëndësishmet janë:

- Aglutinimi makroskopik (i zgjeruar) në epruveta. Një pezullim mikrobesh (diagnosticum) i shtohet serumit të pacientit dhe pas 1 ore në një termostat në një temperaturë prej 37 gradë, shënohet hollimi (titri) i serumit në të cilin ka ndodhur reaksioni. Një reaksion aglutinimi konsiderohet pozitiv kur një precipitat me pastrim të theksuar të lëngut supernatant formohet në fund të epruvetës. Ky precipitat quhet aglutinat.

Në bazë të natyrës së aglutinimit, dallohen aglutinimi i imët (O) dhe i trashë (H). Një aglutinoskop përdoret për të identifikuar aglutinatin me kokrriza të imta. Regjistrimi i rezultateve fillon me tubat e kontrollit. Hollimi i fundit i serumit në të cilin vërehet aglutinimi konsiderohet titri i tij.

Qëllimi i reagimit: zbulimi i antitrupave në serumin e pacientit.

- Mikroskopik (i përshpejtuar ) aglutinimi i përafërt në xhami. Një pikë kulture bakteriale i shtohet një pike serumi imunitar diagnostikues dhe përzihet në mënyrë të barabartë. Reagimi ndodh në temperaturën e dhomës në 5-10 minuta. Pastaj bëhet kontabiliteti. Nëse reagimi është pozitiv, në rënien e serumit vërehet një grumbullim i baktereve në formën e kokrrave ose thekoneve. Qëllimi i reaksionit: përcaktimi i llojit të patogjenit duke përdorur një serum të njohur diagnostikues.

- Reaksioni indirekt (pasiv) i hemaglutinimit (IRHA). Thelbi i këtij reagimi është se qelizat e kuqe të gjakut të deleve janë në gjendje të thithin antigjenet në sipërfaqen e tyre. Nën ndikimin e antitrupave specifikë, qelizat e kuqe të gjakut ngjiten së bashku dhe precipitojnë, duke formuar hemaglutinat në fund. Reagimi është shumë i ndjeshëm dhe specifik. RNGA ju lejon të zbuloni një sasi minimale të antitrupave dhe antigjeneve të dëmtuar të një natyre polisakaride. Ky reagim përdoret në diagnostikimin e shumë sëmundjeve infektive (tifoja dhe tifoja, ethet paratifoide, tuberkulozi etj.).

2. Reaksioni i reshjeve (RP ) – precipitimi i kompleksit antigjen-antitrup. Dallimi kryesor midis RP dhe RA është se në RA përdoret një antigjen korpuskular, ndërsa në RP antigjeni është një substancë koloidale me natyrë proteinike ose polisakaride. Në këtë reagim, antigjeni quhet precipitinogjen dhe antitrupat quhen precipitina. Reagimi kryhet në epruveta duke shtresuar tretësirën e antigjenit në serumin imunitar. Me një raport optimal të antigjenit dhe antitrupave në kufi

Këto tretje formojnë një unazë precipitati. Nëse si antigjen përdoren ekstrakte të organeve dhe indeve të ziera dhe të filtruara, reaksioni quhet reaksion termoprecipitimi (reaksioni Ascoli, i cili përdoret në diagnostikimin e antraksit, murtajës, tularemisë etj.).

Reagimet e reshjeve në agar janë bërë të përhapura: Metoda e thjeshtë e difuzionit, metoda e dyfishtë e difuzionit.

Një lloj reshjesh është reaksioni i flokulimit– për të përcaktuar aktivitetin e serumit toksoid ose antitoksik. Përveç kësaj, ky reagim mund të përdoret për të përcaktuar toksigjenitetin e shtameve Corynebacterium diphtheriae.

Qëllimet specifike:

· Të shpjegojë rolin e antigjeneve si nxitës të një përgjigjeje imune;

· Të përshkruajë strukturën e antigjeneve, duke përfshirë antigjenet e mikroorganizmave;

· Të përshkruajë mekanizmin e reaksionit të aglutinimit;

· Të përshkruajë mekanizmin e reaksionit të precipitimit.

Te jesh i afte te:

· Të shpjegojë rolin e antigjeneve si nxitës të një përgjigjeje imune;

· Të përshkruajë strukturën e antitrupave (klasa të ndryshme imunoglobulinash);

· Të analizojë mekanizmin e ndërveprimit të antitrupave me antigjenet;

· Të interpretojë rezultatet e reaksionit të aglutinimit;

· Të interpretojë rezultatet e reaksionit të reshjeve;

· Analizoni rezultatet e marra.

Pyetje teorike:

1. Përkufizimi i konceptit të "antigjeneve", "antitrupave".

2. Roli i antigjeneve si nxites te pergjigjes imune.

3. Struktura e antitrupave (klasa të ndryshme imunoglobulinash).

4. Mekanizmi i ndërveprimit të antitrupave me antigjenet.

5. Reaksionet imune, roli i tyre në përgjigjen imune dhe diagnostikimin e sëmundjeve infektive.

6. Mekanizmi i reaksionit të aglutinimit.

7. Mekanizmi i reaksionit të reshjeve.

Detyrat praktike të kryera në klasë:

1. Kryerja e një reaksioni aglutinimi për të zbuluar antitrupat në serumin e pacientit.

2. Vendosja e një reaksioni mikroaglutinimi në xhami me serum diagnostikues për të identifikuar një kulturë të pastër bakteresh.

3. Vlerësimi i rezultateve të reaksionit të aglutinimit.

4. Vendosja e një reaksioni precipitimi për të zbuluar antigjenin bakterial.

5. Vlerësimi i rezultateve të reaksionit të reshjeve.

6. Vlerësimi i rezultateve të reaksionit indirekt të hemaglutinimit.

7. Hartimi i protokollit.

Literatura:

1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologjia me virologji dhe imunologji - Kyiv: Shkolla e Lartë, 1992.- 431 f.

2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiologji.- M.: Mjekësi, 1998.- 336 f.

3. Mikrobiologjia mjekësore /Redaktuar nga V.P. Pokrovsky – M.: GEOTAR-MED, 2001. – 768 f.

4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Mikrobiologjia mjekësore, imunologjia dhe virologjia / Tekst mësimor për universitetet mjekësore, Shën Petersburg: “Literatura speciale”, 1998. - 592 f.

5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologjia / Teksti mësimor - Botimi i 2-të, i rishikuar. dhe shtesë – M.: Mjekësi, 1983.- 512 f.

6. Shënime leksioni.

Literaturë shtesë:

1. Titov M.V. Sëmundjet infektive - K., 1995. – 321 f.

2. Shuvalova E.P. Sëmundjet infektive – M.: Mjekësi, 1990.- 559 f.

në mikrobiologji

"Reaksioni i aglutinimit dhe llojet e tij (RA)"

Plani:

1. Hyrje………………………………………………………………………………..3

2. RA në xhami………………………………………………………………………………….4

3. Provëza RA…………………………………………………………………………………………….5

4. Literatura e përdorur……………………………………………………………………..7

1. Hyrje.

Ndërveprimi i antigjenit mikrobial dhe antitrupave është rreptësisht specifik në natyrë dhe synon në trupin e kafshës neutralizimin e patogjenit dhe toksinave të tij. Ndërveprimi i antigjenit dhe antitrupave in vitro, në kushte të caktuara, shoqërohet me dukuri të dukshme (aglutinim, precipitim, lizë imune), gjë që lejon përdorimin e reaksioneve AG-AT, të quajtura serologjike (nga serumi latin), për qëllime praktike. Biofabrikat prodhojnë antigjene dhe serume imune (antitrupa) të një natyre specifike të njohur (diagnostike). Duke përdorur serume të tilla në reaksionet serologjike, është e mundur të identifikohet një mikroorganizëm i panjohur ose, duke përdorur një antigjen të njohur, të zbulohen në trup antitrupat e sintetizuara në përgjigje të futjes së një patogjeni, dhe kështu të bëhet një diagnozë (diagnoza serologjike). Përveç kësaj, reaksionet serologjike mund të përdoren për të vlerësuar intensitetin e përgjigjes imune pas vaksinimit ose një sëmundje infektive.

Reaksionet e aglutinimit, si aglutinimi indirekt dhe Coombs, bazohen në ndërveprimin in vitro të antigjeneve korpuskulare me antitrupat dhe aftësinë e komplekseve që rezultojnë për të precipituar. Si antigjene korpuskulare përdoren qelizat bakteriale ose antigjenet e tretshme të nxjerra nga mikroorganizmat dhe të thithur në trupat bartëse: qelizat e kuqe të gjakut, grimcat e lateksit, etj.

Përcaktuesit antigjenikë të antigjeneve korpuskulare bashkëveprojnë në mënyrë specifike me antitrupat homologë (faza specifike, e padukshme e reaksionit), dhe më pas komplekset antigjen-antitrup formojnë konglomerate të mëdha të dukshme me sy të lirë, të cilat precipitojnë - një aglutinate (faza jo specifike, e dukshme e reagimit ). Format pa flagjelate të mikrobeve (Brucellae) prodhojnë aglutinantë të grimcuar, ndërsa format me flagjela (Escherichia, Salmonella) prodhojnë aglutinantë pambuku të mëdhenj, të cilët vendosen në fund të epruvetës në formën e një ombrellë të përmbysur dhe thyhen lehtësisht kur tunden. Antigjenet dhe antitrupat ndërveprojnë vetëm në prani të një elektroliti (0.8% zgjidhje klorur natriumi). Ecuria e reaksionit ndikohet nga përqendrimi i kripës në elektrolit, numri i qelizave mikrobike në suspension, përqendrimi në serum, pH, temperatura dhe faktorë të tjerë.

Reaksioni i aglutinimit (ra).

Ka aglutinim specifik, i cili bazohet në ndërveprimin e antigjenit Me antitrup homolog , të përfshira në trupin e kafshës në të cilën është futur ky antigjen (imunoaglutinimi); jospecifike (kimike), që rrjedhin nga ndryshimet në pH të mjedisit, përqendrimi i elektroliteve; spontane, e cila vërehet kur bakteret (në formë R) pezullohen në tretësirë ​​fiziologjike dhe kur nxehen, gjë që shoqërohet me ndryshim të gjendjes koloidale të qelizës bakteriale. Antigjeni , i përfshirë në RA quhet aglutinogen, antitrupi quhet aglutininë dhe precipitati që rezulton quhet aglutinat. Kur formohet një aglutinat, raporti sasior i antigjenit dhe antitrupave është i rëndësishëm (dukuri optimale). Me një tepricë ose mungesë të antitrupave, ndodh një vonesë.

Reaksioni i aglutinimit (RA) është një nga reaksionet e para imunologjike të përdorura në praktikën mikrobiologjike. Për herë të parë (1895), F. Vidal përdori RA për të diagnostikuar ethet tifoide. Më vonë (1897), A. Wright përdori të njëjtin reagim për të diagnostikuar brucelozën tek njerëzit. RA ka gjetur aplikim edhe në diagnostikimin e pullorozës tek pulat, leptospirozës, abortit infektiv të mares, si dhe për tipizimin e kulturave mikrobike të panjohura duke përdorur një serum të njohur aglutinues. RA është shumë e ndjeshme; mund të përdoret për të zbuluar 0.01 μg të azotit të proteinës së antitrupave në 1 ml.

Janë zhvilluar disa variante të reaksionit të aglutinimit, të cilat ndryshojnë në zbatimin metodologjik dhe qëllimin e studimit.

2. Ra në xhami.

Në këtë variant të RA, subjektet e testimit mund të jenë serum ose antigjen, por më shpesh ky opsion përdoret për të identifikuar mikroorganizmat.

1. Për të identifikuar mikroorganizmin (m/o), një pikë e një serumi të njohur aglutinues, për shembull serumi i Salmonellës, dhe një pikë tretësirë ​​fiziologjike (kontrolli) aplikohen veçmas në një rrëshqitës qelqi pa yndyrë. Më pas, duke përdorur një lak bakteriologjik, masa bakteriale e kulturës që studiohet merret nga një koloni në një enë Petri ose nga sipërfaqja e një MPA të pjerrët në një epruvetë dhe pezullohet veçmas në serumin imunitar dhe tretësirën fiziologjike derisa të krijohet një suspension homogjen. fituar. Rezultati merret parasysh pas 2...4 minutash.

Kontabiliteti i rezultateve: nuk duhet të ketë ndryshime në mostrën e kontrollit. Nëse kultura bakteriale përputhet në mënyrë specifike me serumin imunitar, shfaqen thekonet e aglutinimit (rezultat pozitiv nëse nuk ka fenomen aglutinimi, arrihet në përfundimin se kultura bakteriale në studim nuk korrespondon me serumin imunitar);

2. Le të shqyrtojmë zbulimin e anittels në serumin e gjakut të testuar duke përdorur shembullin e testit rozë bengal të përdorur në serodiagnozën e brucelozës. 0,3 ml të serumit të gjakut të kafshës së testuar dhe 0,03 ml të antigjenit të brucelozës (qelizat e Brucellës me njolla trëndafili-Bengal) aplikohen në një rrëshqitje xhami. Komponentët përzihen plotësisht duke tundur gotën dhe rezultati merret parasysh pas 4 minutash.

Regjistrimi i rezultateve: nëse reagimi është pozitiv, shfaqen thekon rozë të aglutinatit. Një reagim serologjik i këtij lloji klasifikohet si cilësor, pasi mund të përdoret për të zbuluar antitrupa ndaj patogjenit në serumin e gjakut të kafshës, por është e pamundur të vlerësohet përmbajtja e tyre sasiore.