Реакция агглютинации микробиология. Иммунология

Реакция агглютинации.

Реакция агглютинации – это склеивание и выпадение в осадок микробных или других клеток (эритроцитов) под действием антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен агглютинации) – образование осадка, который называется агглютинатом.

Эту реакцию используют для серодиагностики и сероидентификации . РА используют для серодиагностики (обнаружение антител в сыворотке крови больных) брюшного тифа и паратифа (реакция Видаля), бруцеллеза (реакция Райта), туляремии и лептоспироза . РА используют для сероидентификации (определения вида возбудителя, выделенного от больного) при кишечных инфекциях, коклюше, холере и др.

Компоненты реакции:

1. Антиген (агглютиноген) – это целые (не разрушенные) микробные или другие клетки (корпускулярный , нерастворимый антиген ). Агглютиногены – это взвесь живых или убитых микробных клеток или других каких-либо клеток. Антигены могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестный агглютиноген – это микробная культура, выделенная из организма больного, которую необходимо определить. Известный антиген – диагностикум – диагностический препарат - взвесь убитых микробов известного вида в физиологическом растворе. Эта взвесь мутная (непрозрачная ), т.к. микробные клетки не растворяются, а остаются целыми. Известный агглютиноген будет использоваться для обнаружения неизвестных антител в сыворотке крови больных.

2. Антитело (агглютинин) – находится в сыворотке крови. Антитела также могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестные антитела, которые нужно определить, находятся в сыворотке крови больного человека . Известные антитела находятся в иммунных диагностических сыворотках , которые называются агглютинирующими сыворотками . Они используются для сероидентификации, т.е. для определения неизвестного антигена – вида микробной культуры.

3. Электролит – 0,9% раствор хлорида натрия.

Способы постановки РА.

1. Ориентировочная (пластинчатая) РА – проводится на стекле. На предметное стекло наносят 2 капли сыворотки и 1 каплю изотонического раствора. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора петлей вносят микробную культуру и перемешивают. Капля изотонического раствора с микробами – контроль антигена , капля сыворотки без микробов – контроль антитела , капля сыворотки с микробами – опыт. Если в сыворотке имеются антитела, соответствующие микробным антигенам, которые с ней смешиваются, то антитела и антигены будут специфически связываться друг с другом и через 1 – 3 мин в опытной капле появятся хлопья агглютината. Контроль антигена должен быть мутным, а контроль антитела – прозрачным. Учет результатов реакции проводится по появлению хлопьев агглютината . Если выпадают хлопья – реакция положительна, т.е. антиген соответствует антителу и по антигену можно определить антитело или наоборот. Если остается помутнение – реакция отрицательная.

2. Развернутая реакция агглютинации – проводится в пробирках. Вначале готовят 2-хкратные разведения сыворотки крови больного человека от 1:50 до 1:1600. В 6 пробирок наливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую пробирку вносят 1 мл сыворотки крови больного в разведении 1:50, перемешивают и получают разведение 1:100, затем 1 мл разведения 1:100 переносят во вторую пробирку и получают разведение 1:200 и т.д. Две пробирки оставляют для контроля антигена и сыворотки. В контроль сыворотки добавляют только сыворотку в разведении 1:50, в контроль антигена – только антиген. Во все остальные пробирки добавляют 0,1 мл антигена - диагностикума (О- или Н-) и ставят все пробирки в термостат при 37°С на 18-20 часов. Учет результатов реакции проводят по характеру, количеству образовавшегося осадка (агглютината) и степени мутности. Учет проводят только при следующих результатах в контролях: контроль сыворотки – прозрачный, контроль антигена – мутный. О-антитела дают мелкозернистый осадок. Н-антитела – крупнозернистый. По последней пробирке, в которой еще видна реакция агглютинации, устанавливают диагностический титр.

При серодиагностике заболеваний важно не просто обнаружить специфические антитела к определенному возбудителю, но и выявить их количество, т.е. установить такой титр антител, когда можно говорить о наличии заболевания, вызванного этим возбудителем. Этот титр и называется диагностическим титром. Например, для диагностики брюшного тифа нужно выявить титр антител – 1:400, но не меньше. Еще более точные результаты дает выявление нарастания антител в парных сыворотках.Сыворотку больного отбирают в начале заболевания и через 3 – 5 или более дней. Если титр антител возрастает не менее, чем в 4 раза, следовательно, можно говорить о текущем заболевании.

13.1. Реакции антиген-антитело и их применение

При введении антигена в организме образуются антитела. Антитела комплементарны антигену, вызвавшему их синтез, и способны с ним связываться. Связывание антигенов с антителами состоит из двух фаз. Первая фаза - специфическая, при которой происходит быстрое связывание антигенной детерминанты с активным центром Fab-фрагмента антител. Следует отметить, что связывание обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными и гидрофобными взаимодействиями. Прочность связи определяется степенью пространственного соответствия активного центра антитела и эпитопа антигена. После специфической фазы наступает более медленная - неспецифическая, которая проявляется видимым физическим явлением (например, образованием хлопьев при агглютинации и др.).

Иммунные реакции - это взаимодействие между антителами и антигенами, причем эти реакции специфичны и обладают высокой чувствительностью. Они широко используются в медицинской практике. С помощью иммунных реакций можно решить следующие задачи:

Определение неизвестных антител по известным антигенам (антигенный диагностикум). Такая задача стоит, когда необходимо определить в сыворотке крови больного антител к возбудителю (серодиагностика). Нахождение антител позволяет подтвердить диагноз;

Определение неизвестных антигенов по известным антителам (диагностическая сыворотка). Это исследование проводят при идентификации культуры возбудителя, выделенной из материала больного (серотипирование), а также при обнаружении

антигенов микробов и их токсинов в крови и других биологических жидкостях. Существует много разновидностей иммунных реакций, различающихся по технике постановки и регистрируемому эффекту. Это реакции агглютинации (РА), преципитации (РП), реакции с участием комплемента (РСК), реакции с использованием меченых компонентов (РИФ, ИФА, РИА).

13.2. Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (РА) - это иммунная реакция взаимодействия антигена с антителами в присутствии электролитов, причем антиген находится в корпускулярном состоянии (эритроциты, бактерии, частицы латекса с адсорбированными антигенами). При агглютинации происходит склеивание корпускулярных антигенов антителами, что проявляется образованием хлопьевидного осадка. Образование хлопьев происходит за счет того, что антитела имеют два активных центра, а антигены поливалентны, т.е. имеют несколько антигенных детерминант. РА применяют для идентификации возбудителя, выделенного из материала больного, а также для обнаружения в сыворотке крови больного антител к возбудителю (например, реакции Райта и Хеддлсона при бруцеллезе, реакция Видаля при брюшном тифе и паратифах).

Самый простой способ постановки РА - реакция на стекле, это ориентировочная РА, которая применяется для определения возбудителя, выделенного от больного. При постановке реакции на предметное стекло наносят диагностическую агглютинирующую сыворотку (в разведении 1:10 или 1:20), затем вносят культуру от больного. Реакция положительная, если в капле появляется хлопьевидный осадок. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. Если диагностическая агглютинирующая сыворотка неадсорбированная 1 , то ее разводят (до титра - разведения, до которого должна происходить агглютинация), т.е. ставят развернутую РА в пробирках с увеличивающимися

1 Неадсорбированная агглютинирующая сыворотка может агглютинировать родственные бактерии, имеющие общие (перекрестно реагирующие) антигены. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.

разведениями агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя, выделенного от больного. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости в пробирках. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Реакция сопровождается контролями: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Для определения в сыворотке крови больного антител к возбудителю используют развернутую РА. При ее постановке в пробирках разводят сыворотку крови больного и добавляют в пробирки равное количество взвеси диагностикума (взвесь убитых микробов). После инкубации определяют наибольшее разведение сыворотки, при котором произошла агглютинация, т.е. образовался осадок (титр сыворотки). При этом реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА или РПГА) является разновидностью РА. Этот метод обладает высокой чувствительностью. С помощью РНГА можно решить две задачи: определить антитела в сыворотке крови больного, к которой добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум, представляющий собой эритроциты, на которых адсорбированы известные антигены; определить наличие антигенов в исследуемом материале. В этом случае реакцию иногда называют реакцией обратной непрямой гемагглютинацией (РОНГА). При постановке к исследуемому материалу добавляют антительный эритроцитарный диагностикум (эритроциты с адсорбированными на их поверхности антителами). Эритроциты в этой реакции выполняют роль носителей и пассивно вовлекаются в образование иммунных агрегатов. При положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»); при отсутствии агглютинации эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями.

Реакция коагглютинации используется для определения клеток возбудителя (антигенов) с помощью антител, адсорбированных на Staphylococcus aureus, содержащем белок А. Белок А обладает сродством к Fc-фрагменту иммуноглобулинов. Благодаря этому антитела связываются с стафилококком опосредованно через Fc- фрагмент, а Fab-фрагменты ориентированы наружу и способны взаимодействовать с соответствующими микробами, выделенными от больных. При этом образуются хлопья.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) используется при диагностике вирусных инфекций, причем только инфекций, вызываемых гемагглютинирующими вирусами. Эти вирусы содержат на своей поверхности белок - гемагглютинин, который ответствен за реакцией гемагглютинации (РГА) при добавлении к вирусам эритроцитов. РТГА заключается в блокировании антителами вирусных антигенов, в результате чего вирусы теряют способность агглютинировать эритроциты.

Реакция Кумбса - РА для определения неполных антител. При некоторых инфекционных заболеваниях, например при бруцеллезе, в сыворотке крови больного циркулируют неполные антитела к возбудителю. Неполные антитела называют блокирующими, так как они имеют один антигенсвязывающий участок, а не два, как полноценные антитела. Поэтому при добавлении антигенного диагностикума неполные антитела связываются с антигенами, но не склеивают их. Для проявления реакции добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела к иммуноглобулинам человека), которая приведет к агглютинации иммунных комплексов (антигенный диагностикум + неполные антитела), образовавшихся в первой стадии реакции.

Непрямую реакцию Кумбса применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких больных обнаруживают неполные одновалентные антирезусные антитела. Они специфически взаимодействуют с резусположительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Поэтому в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку, что вызывает агглютинацию эритроцитов. С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например гемолитическую болезнь новорожденных, обусловленную резус-конфликтом.

РА для определения групп крови основана на агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки к антигенам групп крови А(II), B(III). Контролем являются сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка AB(IV) группы крови, и антигены эритроцитов групп А(П) и B(III). В качестве отрицательного контроля применяют эритроциты группы 0(I), поскольку они не имеют антигенов.

Для определения резус-фактора используют антирезусные сыворотки (не менее двух различных серий). При наличии на мембране исследуемых эритроцитов резус-антигена происходит агглютинация этих клеток.

13.3. Реакция преципитации

РП - это иммунная реакция взаимодействия антител с антигенами в присутствии электролитов, причем антиген находится в растворимом состоянии. При преципитации происходит осаждение растворимых антигенов антителами, что проявляется помутнением в виде полос преципитации. Образование видимого преципитата наблюдается при смешивании обоих реагентов в эквивалентных соотношениях. Избыток одного из них снижает количество осаждающихся иммунных комплексов. Существуют различные способы постановки реакции преципитации.

Реакция кольцепреципитации ставится в преципитационных пробирках с малым диаметром. В пробирку вносят иммунную сыворотку и осторожно наслаивают растворимый антиген. При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо молочного цвета. Реакция кольцепреципитации, с помощью которой определяют наличие антигенов в органах и тканях, экстракты которых кипятят и фильтруют, называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи для определения термостабильного сибиреязвенного антигена).

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Эта реакция проводится в агаровом геле. В слое геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки и заполняют их антигеном и иммунной сывороткой соответственно. После этого антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в геле и становятся видимыми как линии преци-

питации. Эту реакцию можно использовать для определения неизвестных антигенов или антител, а также для проверки сходства между различными антигенами: если антигены идентичны, линии преципитации сливаются, если антигены неидентичны, линии преципитации пересекаются, если антигены частично идентичны, формируется шпора.

Реакция радиальной иммунодиффузии. В расплавленный агаровый гель добавляют антитела и наносят гель равномерным слоем на стекло. В геле вырезают лунки и вносят в них стандартный объем различных по концентрации растворов антигена. Во время инкубации антигены радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации. Этот метод используется для определения антигенов или антител в исследуемом растворе (например для определения концентрации иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови).

Иммуноэлектрофорез. Предварительно электрофоретически разделяют смесь антигенов, затем в канавку, идущую вдоль направления движения белков, вносят преципитирующую антисыворотку. Антигены и антитела диффундируют в гель навстречу друг другу; взаимодействуя, они образуют дугообразные линии преципитации.

Реакция флоккуляции (по Рамону) - разновидность реакции преципитации, которая используется для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. Реакцию проводят в пробирках. В пробирке, где анатоксин и антитоксин находятся в эквивалентном соотношении, наблюдается помутнение.

13.4. Реакция связывания комплемента

Антитела, взаимодействуя с соответствующим антигеном, связывают добавленный комплемент (1-я система). Индикатором связывания комплемента служат эритроциты, сенсибилизированные гемолитической сывороткой, т.е. антителами к эритроцитам (2-я система). Если комплемент не фиксируется в 1-й системе, т.е. не происходит реакция антиген-антитело, то сенсибилизированные эритроциты полностью лизируются (отрицательная реакция). При связывании комплемента иммунными комплексами 1-й системы после добавления сенсибилизированных эритроцитов гемолиз от-

сутствует (положительная реакция). Реакция связывания комплемента используется для диагностики инфекционных болезней (гонореи, сифилиса, гриппа и др.).

13.5. Реакция нейтрализации

Микробы и их токсины оказывают повреждающее действие на органы и ткани организма человека. Антитела способны связываться с этими повреждающими агентами и блокировать их, т.е. нейтрализовать. На этой особенности антител основана диагностическая реакция нейтрализации. Ее проводят путем введения смеси антиген-антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). Например для обнаружения токсинов в материале больного животным 1-й группы вводят материал больного. Животным 2-й группы вводят аналогичный материал, предварительно обработанный соответствующей антисывороткой. Животные 1-й группы при наличии токсина в материале погибают. Вторая группа животных выживает, повреждающее действие токсина не проявляется, так как происходит его нейтрализация.

13.6. Реакции с использованием меченых антител или антигенов

13.6.1. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса)

Этот метод используется для экспресс-диагностики. С его помощью можно выявлять как микробные антигены, так и антитела.

Прямой метод РИФ - иммунная реакция взаимодействия антител с антигенами, причем антитела метят флюорохромом - веществом, способным при попадании света определенной длины волны испускать кванты света также определенной длины волны. Особенность постановки этого метода заключается в необходимости удаления непрореагировавших компонентов, чтобы исключить выявление неспецифического свечения. Для этого проводят отмывание от непрореагировавших антител. Результаты оценивают с помощью люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся на темном фоне по периферии клетки.

Непрямой метод РИФ используется чаще предыдущего. Эта реакция проводится в два этапа. На первом этапе антигены взаи-

модействуют с соответствующими антителами, образуя иммунные комплексы. Все компоненты, которые не прореагировали (т.е. не в составе иммунных комплексов), должны быть удалены отмыванием. На втором этапе образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью флюорохромированной антиглобулиновой сыворотки. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антитела к иммуноглобулинам кролика, меченные флюорохромом. Результаты оценивают с помощью люминесцентного микроскопа.

13.6.2. Иммуноферментный метод или анализ

ИФА - наиболее распространенный современный метод, используемый для диагностики вирусных, бактериальных, протозойных инфекций, в частности для диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов и др.

Модификаций ИФА очень много. Широко используется твердофазный неконкурентный вариант ИФА. Его проводят в 96-луночных полистироловых планшетах (твердая фаза). При проведении реакции необходимо на каждом этапе отмывать непрореагировавшие компоненты. При определении антител в лунки, на которых сорбированы антигены, вносят исследуемую сыворотку крови, затем антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом. Проявляют реакцию, добавляя субстрат для фермента. В присутствии фермента субстрат изменяется, причем ферментсубстратный комплекс подбирают таким образом, чтобы образующийся в реакции продукт был цветным. Таким образом, при положительной реакции наблюдается изменение цвета раствора. Для определения антигенов твердофазный носитель сенсибилизируется антителами, затем последовательно вносятся исследуемый материал (антигены) и сыворотка к антигенам, меченная ферментом. Для проявления реакции вносят субстрат для фермента. Изменение цвета раствора происходит при положительной реакции.

13.6.3. Иммуноблоттинг

Этот метод основан на сочетании электрофореза и ИФА. При проведении иммуноблоттинга (блоттинг от англ. blot - пятно) сложную смесь антигенов вначале подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. Полученные фракционированные анти-

генные пептиды переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Затем блоты обрабатывают антителами к специфическому антигену, меченными ферментом, т.е. проводят ИФА блота. Иммуноблоттинг используют в диагностике инфекций, например ВИЧ.

13.6.4. Иммунная электронная микроскопия

Метод заключается в микроскопировании в электронном микроскопе вирусов (реже других микробов), предварительно обработанных соответствующей иммунной сывороткой, меченной электроннооптически-плотными препаратами, например ферритином - железосодержащим белком.

13.7. Проточная цитометрия

Клетки крови дифференцируют на основе лазерной цитофлюорометрии. Для этого искомые клетки окрашивают флюоресцирующими моноклональными антителами к CD-антигенам. Образец крови после обработки мечеными антителами пропускают через тонкую трубку и через него пропускают лазерный луч, который возбуждает свечение флюорохрома. Интенсивность флюоресценции коррелирует с плотностью антигенов на поверхности клеток и может быть количественно измерена с помощью фотоумножителя. Полученные результаты преобразуются в гистограмму.

Проточную цитометрию применяют для определения иммунного статуса (содержание основных популяций лимфоцитов, содержание внутриклеточных и внеклеточных цитокинов, функциональная активность NK-клеток, активность фагоцитоза и др.).

В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген);

2) антитело (агглютинин)

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

Ориентировочная реакция агглютинации (РА)

Ориентировочная, или пластинчатая, РА ставится на предметном стекле при комнатной температуре. Для этого пастеровской пипеткой на стекло наносят раздельно каплю сыворотки в разведении 1:10 - 1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида. В ту и другую бактериологической петлей вносят колонии или суточную культуру бактерий (каплю диагностикума) и тщательно перемешивают их. Реакции учитывают через несколько минут визуально, иногда с помощью лупы (х5). При положительной РА в капле с сывороткой отмечают появление крупных и мелких хлопьев, при отрицательной - сыворотка остается равномерно мутной.

Рис. 2. Ориентировочная реакция агглютинации.

Развернутая реакция агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий.

В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).

За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

Рис. 7. Развернутая реакция агглютинации.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА)

Реакция ставится:

1) для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий и других высокодисперстных веществ, риккетсий и вирусов, комплексы которых с агглютининами в обычных РА увидеть не удается,

2) для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперстным веществам и мельчайшим микроорганизмам.

Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на инертных частицах (латекс, целлюлоза, полистерол, оксид бария и др. или эритроциты барана, I(0)-группы крови человека)

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты . Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика). Если нагрузить эритроциты антителами (эритроцитарный антительный диагностикум), то можно применять для выявления антигенов.

Рис. 3. Схема РПГА: эритроциты (1), нагруженные антигеном (3), связываются специфическими антителами (4).

Постановка . В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.

Учет . В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Рис.4. Учет РНГА (РПГА).

Учет результатов РНГА, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками. Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Рис. 3. Постановка и результат РНГА.

Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

Рис. 8. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (схема).

Принцип реакции основан на способности АТ связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

Типирование вируса проводят в реакции РТГА с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса типа А с антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и другие могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток

Рис. 9. Результаты РТГА при типировании вируса гриппа

Условные обозначения: - торможение гемагглютинации (пуговка) ; - гемагглютинация (зонтик).

Выводы: Исследуемый материал содержит вирус гриппа тип А с антигеном H3N2

№ 29 Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение.
Реакция агглютинации - простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.
Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра - рис. 13.1). РА используют для:
1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;
2) определения возбудителя , выделенного от больного;
3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.
Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.
Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее. Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.
Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что
затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены
перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела,
специфичные только к данной бактерии.

Агглютинация - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора хлорида натрия). Группы склеенных бактерий (клеток) называют агглютинатом. Для реакции агглютинации необходимы следующие компоненты:

1. Антитела (агглютинины), которые находятся в сыворотке больного или иммунного животного.

2. Антиген - взвесь живых или убитых микробов, эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический (0,9%) раствор хлорида натрия.

Реакцию агглютинации для серодиагностики применяют при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), при бруцеллезе (реакция Райта и Хеддлсона), туляремии и т.д. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном известный микроб. При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют для диагностики кишечных инфекций, коклюша и др.

Методы постановки РА

Ориентировочная РА на стекле

Развернутая РА

(объемный метод)

Реакция коагглютинации

Развернутая РА на стекле (сероидентификация)

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 - 1:100. Капли на стекло необходимо наносить так, чтобы между ними было расстояние. Культуру петлёй или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического, раствора хлорида натрия и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.

Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора хлорида натрия, которая является контролем антигена. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остаётся прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерная муть, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считается положительным.

Диагностическая Физиологический

сыворотка +культура раствор + культура

Развёрнутая реакция агглютинации (объемный метод). Готовят последовательные, чаще всего двукратные, разведения сыворотки. Метод называют объёмным. Для определения титра антител в сыворотке крови возьмите 6 пробирок. В первую пробирку налейте 1 мл исходного разведения сыворотки 1:50 и во все 6 пробирок градуированной пипеткой внесите по 1 мл физиологического раствора. В первой пробирке получится разведение сыворотки 1:100 при объёме 2 мл. Из первой пробирки 1 мл перенесите во вторую пробирку, где разведение станет 1:200. Так сделайте ряд последовательных разведений сыворотки в 5 первых пробирках (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Из пятой пробирки 1 мл вылейте в дезинфицирующий раствор. Во все 6 пробирок добавьте по 2 капли диагностикума. Шестая пробирка является контролем культуры, так как содержит только физиологический раствор и диагностикум.

Ингредиенты	номер пробирки
						контроль сыворотки	контроль диагности-кума
Физиологический
Сыворотка больного в
разведении 1:50
Диагностикум (капли)
Разведение сыворотки

Такой контроль необходим для исключения спонтанной агглютинации культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 часа, а затем оставляют на сутки при комнатной температуре, после чего производят учёт результатов реакции агглютинации. При постановке реакции агглютинации с сыворотками детей первых месяцев жизни в связи с функциональной неполноценностью антителообразования необходимо выявление более низких титров антител, что учитывается при разведении сыворотки. Исходное разведение сыворотки берут 1:25. В первой пробирке получают разведение 1:50, затем 1:100 и т.д.

При положительном результате реакции в пробирках видны склеевшиеся клетки в виде зерен или хлопьев на фоне прозрачной жидкости. Агглютинат постепенно оседает на дно в виде «зонтика», а жидкость над осадком просветляется. Контроль антигена равномерно мутный.

По характеру осадка различают мелко- и крупнозернистую (хлопьевидную) агглютинацию. Мелкозернистая агглютинация получается при работе с О-сыворотками. Крупнозернистая - при взаимодействии подвижных микробов со жгутиковыми Н-сыворотками. Она наступает быстрее мелкозернистой, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается.

Интенсивность реакции выражается следующим образом:

Все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный;

Осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный;

Осадок еще меньше, жидкость мутнее. Результат реакции сомнительный;

на дне пробирки незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции;

Осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции