Реакция гемолиза.

Реакция гемолиза (РГ) – это разрушение эритроцитов при действии антител при участии комплемента.

Компоненты РГ.

1. Антиген - 3% взвесь эритроцитов на изотоническом растворе хлорида натрия;

2. Антитело - гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам (гемолизины); сыворотку получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана;

3. Комплемент – система белков крови, которые адсорбируюся на комплексе антиген-антитело и формируют мембраноатакующий комплекс, который разрушает антиген, т.е. разрушает эритроциты или, по-другому, вызывает лизис эритроцитов (гемолиз ). В качестве комплемента используется свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок.

Если в пробирку поместить в определенных количествах эритроциты, гемолитическую сыворотку и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет разрушение (гемолиз) эритроцитов, в результате чего смесь из темно-красной станет розовой ("лаковая кровь").

Реакция гемолиза используется в качестве индикатора при постановке реакции связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК)– это сложная серологическая реакция, в которой участвуют 2 системы антиген-антитело и комплемент. 1-ая система – специфическая , 2-ая – гемолитическая система.

Эта реакция разработана Ж.Борде и О.Жангу, которые установили, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент. Видимого эффекта при этом не наблюдается , поэтому для выявления связывания комплемента (а следовательно, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е. в качестве индикатора используется 2-ая – гемолитическая система.

РСК используется чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбудителю заболевания в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заболеваний. РСК также используется для сероидентификации.

Компоненты РСК.

1. Антиген – экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген может быть как корпускулярным (нерастворимым), так и молекулярным (растворимым).

2 . Антитело – сыворотка крови больного человека (при серодиагностике) или иммунная диагностическая сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации).

3. Эритроциты барана – антигены гемолитической реакции.

4. Гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана.

5. Комплемент – свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная).

6. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Постановка РСК.

Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитическая сыворотка и комплемент титруются (определяется их титр). Сыворотка больного прогревается при 56°С в течение 30 мин.

РСК проводят в 2 фазы .

I фаза – специфическая : в одной пробирке готовят специфическую систему - смешивают равные количества известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в другой пробирке готовят гемолитическую систему – смесь эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37°С на 30 мин. Одновременно готовят контроли на антиген, комплемент и гемосистему, контрольные пробы с сывороткой заведомо больного человека (положительная сыворотка) и заведомо здорового человека (отрицательная сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин.

II фаза – индикаторная : в исходную смесь и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после выдерживания в термостате 30 мин.

Учет результатов РСК проводятпри безупречных результатах в контролях.

Положительная реакция (человек болен и в его сыворотке имеются соответствующие антитела к возбудителю заболевания - антигену): в I фазе в специфической системе образуются комплексы антиген-антитело, с которыми связывается комплемент, после добавления гемолитической системы во II фазе гемолиз не наблюдается, так как комплемент связан 1-ой специфической системой. Видимый эффект – образование осадка эритроцитов.

Отрицательная реакция (человек здоров и в его сыворотке нет антител к возбудителю заболевания): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I фазе остается свободным, после добавления гемолитической системы во II фазе комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – "лаковая кровь".

В диагностике инфекционных заболеваний также используютсяреакция нейтрализация (РН) токсина антитоксической сывороткой , реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА).

61. Реакции с участием комплемента. Реакция связывания комплемента. Механизм, компоненты, способы постановки, применение. Реакция радиального гемолиза

Реакции с участием комплемента

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом анти­ген-антитело (реакция связывания компле­мента, радиального гемолиза и др.).

Реакция связывания комплемента (РСК ) за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc -фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп­лексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антите­ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан­титело не соответствуют друг другу (в иссле­дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан- тиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз; реакция отрицательная.

РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана).

Эту реакцию применяют для обнаружения антител в сыворотке крови больных при бактериальных, вирусных, протозойных инфекциях, а также для определения и типирования вирусов, выделенных у больных. РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых, кроме антигена, антитела и комплемента, участвует еще и гемолитическая система, выявляющая результаты реакции. РСК протекает в две фазы: первая - взаимодействие антигена с антителом при участии комплемента и вторая - выявление степени связывания комплемента при помощи гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, полученной путем иммунизации лабораторных животных, эритроцитами. Эритроциты обрабатывают - сенсибилизируют, присоединяя к ним сыворотку при температуре 37°С, в течение 30 мин. Лизис сенсибилизированных эритроцитов барана наступает только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. В отсутствие его эритроциты не изменяются. Результаты РСК зависят от наличия в исследуемой сыворотке антител. Если сыворотка содержит антитела, гомологичные антигену, используемому в реакции, то образующийся комплекс антиген - антитело присоединяет, связывает комплемент. При добавлении гемолитической системы в этом случае гемолиза не произойдет, так как весь комплемент расходуется на специфическую связь комплекса антиген - антитело. Эритроциты остаются не измененными, поэтому отсутствие гемолиза в пробирке регистрируют как положительную РСК. При отсутствии в сыворотке антител, соответствующих антигену, специфический комплекс антиген - антитело не образуется и комплемент остается свободным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и вызывает гемодиз эритроцитов. Разрушение эритроцитов, их гемолиз характеризует отрицательную реакцию.

Для постановки РСК необходимы: сыворотка больного, комплемент, гемолитическая система, состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, а также изотонический раствор хлорида натрия. Реакцию ставят в серологических пробирках. Эритроциты барана получают из дефибринированной крови барана путем троекратного отмывания их изотоническим раствором хлорида натрия. Гемолитическую сыворотку выпускают в готовом виде в ампулах, на этикетке которых указан ее титр, т. е. максимальное разведение сыворотки, которое еще вызывает гемолиз при добавлении к эритроцитам в присутствии комплемента. Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации животных, например кролика эритроцитами барана. При постановке реакции сыворотку используют в тройном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1: 1200, а рабочее разведение 1: 400. В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки (в течение 24-48 ч) или сухой комплемент в ампулах. Предварительно перед постановкой РСК комплемент разводят 1: 10 и титруют для установления титра - наименьшего количества комплемента, которое дает гемолиз эритроцитов при соединении с гемолитической системой, используемой в данной реакции. Учитывая возможные антикомплементарные свойства антигена, при постановке реакции к установленному рабочему титру комплемента делают 20-30% надбавку.
Антигеном для РСК являются взвеси убитых бактерий, экстракты, приготовленные из этих взвесей, отдельные химические фракции микробов. Основное требование к антигену - отсутствие угнетения активности комплемента. Он не должен обладать антикомплементарными свойствами. Для выявления этих свойств антигена комплемент дополнительно титруют в присутствии используемого в реакции антигена. Существуют определенные схемы постановки РСК. Результаты реакции учитывают по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов в гемолитической системе. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде-Жангу), токсоплазмоза, риккетсиозных и вирусных заболеваний.

Реакцию радиального гемолиза (РРГ ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эрит­роциты барана и комплемент. После внесе­ния в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии анти­тел) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, крас­нухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че­го к этому комплексу присоединяются ком­поненты комплемента, вызывая гемолиз.

Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК проводят с участием не только АГ и АТ, но и комплемента. Поскольку она не сопровождается видимыми изменениями, для обнаружения связывания комплемента используют индикаторную гемолитическую систему. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки кролика. В присутствии комплемента в гемолитической сыворотке происходит хорошо наблюдаемый лизис эритроцитов. Принцип метода состоит в том, что если в опыте комплекс АГ-АТ образовался и комплемент связался с ним (т.е. в растворе свободного комплемента не осталось), то лизис эритроцитов не произойдет, и эритроциты осядут на дно пробирки. Если комплекс не формируется, комплемент остается свободным и реагирует с гемолитической системой, вызывая в результате лизис эритроцитов. Этот механизм лежит в основе реакции Вассермана (диагностика сифилиса). Общую активность системы комплемента определяют в так называемой гемолитической системе по РСК. Гемолитическая система представляет собой смесь эритроцитов барана и стандартной специфической антисыворотки, содержащей АТ к этим эритроцитам, но искусственно лишенной собственного комплемента. В такой системе гемолиз эритроцитов не происходит в связи с отсутствием важного звена процесса связывания АТ с АГ - комплемента, разрушенного предварительным нагреванием. Если в такую систему добавить исследуемую сыворотку больного, содержащую комплемент, то образуется иммунный комплекс и произойдут склеивание и гемолиз эритроцитов. Чем больше концентрация комплемента в исследуемой сыворотке, тем более выражен гемолиз эритроцитов.

В норме уровень комплемента сыворотки крови составляет 20-40 гемолитических единиц. При острых инфекционных и воспалительных заболеваниях наблюдается, как правило, увеличение активности комплемента, при хронических - ее уменьшение. Низкие значения гемолитической активности могут отражать врожденную или приобретенную недостаточность отдельных компонентов системы комплемента. Следует отметить, что дефекты данной системы рассматриваются как самые частые наследственные аномалии белков человека. Они могут играть патогенетическую роль при таких заболеваниях и синдромах, как:

• рецидивирующие бактериальные пиогенные инфекции органов дыхания, кожи и других органов: пневмонии, бронхоэктазы, рецидивирующий синусит, пиодермия, генерализованные бактериальные инфекции, септицемия;
• рецидивирующие менингококковые и гонококковые инфекции (менингококковый менингит, диссеминированные гонококковые инфекции, гонококковые артриты и др.);
• аутоиммунные, аллергические заболевания и болезни иммунных комплексов: системная красная волчанка, дерматомиозит, мембранопролиферативный гломерулонефрит, болезнь Шенлейн - Ге- ноха, синдром Шегрена, тромбоцитопеническая пурпура, склеродермия, ювенильный ревматоидный артрит, рецидивирующий ангионевротический отек (особенно часто - ларингоспазм), дерматозы, фоточувствительность и др.

Реакция связывания комплемента используется для лабораторной диагностики риккетсиозов, вирусных инфекций (гриппа, кори, клещевого энцефалита и др.) и основывается на способности комплемента связываться с комплексом АГ-АТ. Комплемент адсорбируется на Ес-фрагменте иммуноглобулинов О и М. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие АГ и АТ. В качестве материала, содержащего АТ, используется исследуемая сыворотка, к которой добавляется известный АГ. К этой системе добавляют стандартный комплемент и инкубируют при 37 °С в течение 1 ч. Вторая фаза - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка кролика, содержащая гемолизины к эритроцитам барана). К смеси АГ-АТ-комплемент (1-я фаза) добавляют индикаторную систему и вновь инкубируют при 37 °С в течение 30-60 мин, после чего оценивают результаты реакции. Разрушение эритроцитов происходит в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ-АТ, то гемолиз эритроцитов не наступает. Гемолиз происходит в том случае, когда в исследуемой сыворотке содержатся специфические АТ к диагностическому АГ. При отсутствии в исследуемой сыворотке специфических АТ комплекс АГ-АТ не образуется, а комплемент остается несвязанным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и происходит гемолиз эритроцитов. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Все компоненты РСК за исключением исследуемой сыворотки должны быть оттитрованы (рис. 10.9).

Рис. 10.9. а - лизис сенсибилизированных эритроцитов в присутствии комплемента: б- отсутствие гемолиза вследствие фиксации комплемента комплексом АГ-АТ; в - лизис эритроцитов в результате отсутствия комплекса АГ-АТ

Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой предполагают наличие антител и добавляют комплемент, инкубируют в термостате 30 минут.

Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана +гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.

При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрицательная (антител в исследуемой сыворотки нет) - комплемент останется свободным и произойдет гемолиз.

РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонорее, сыпного тифа и других заболеваний.

Реакции иммунитета с использованием меченых антигенов и антител основаны на том, что один из ингредиентов, участвующих в реакции (антигены или антитела) соединяют с какой-либо меткой, которую легко можно обнаружить. В качестве метки используют флюорохромы (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электроноплотные соединения (ИЭМ).

Иммуноферментный анализ (ИФА), как и другие реакции иммунитета, используется: 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединён с ферментом (например, пероксидазой). Присутствие фермента определяют с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается. Наиболее широко применяется твёрдофазный ИФА.

1) Обнаружение антигена. Первый этап - адсорбция специфических антител на твёрдой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, если в исследуемом материале имеются антигены, на поверхности твёрдой фазы образуется комплекс антитела - антиген - антитела, меченые ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н 2 О 2 в буферном растворе. Под действием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску.

2) Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-системах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитело. Третий этап - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеческих глобулинов), меченые ферментом. Результаты реакции оценивают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные, которые имеются в коммерческих системах.

ИФА применяется для диагностики многих инфекционных заболеваниях, в частности, ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов.

Иммуноблоттинг - это разновидность ИФА (сочетание электрофореза и ИФА). Методом электрофореза в геле разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем переносят разделённые молекулы на поверхность нитроцеллюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Процесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток - блот (англ. blot - пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов человека, меченую пероксидазой, затем субстрат, который под действием фермента приобретает коричневый цвет. Образуются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным антигенам вируса.

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод позволяет определить количество антигена в исследуемой пробе. Сначала к иммунной сыворотке присоединяют материал, предположительно содержащий антиген, затем - известный антиген, меченный радиоизотопом, например I 125 . В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного меченого антигена с ограниченным количеством антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с немеченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счётчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяется специфическая антисыворотка, меченая электроноплотным веществом. В качестве метки применяют металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин) или коллоидное золото. При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы гриппа с присоединившимися к ним тёмными точками - молекулами меченых антител.

Контрольные вопросы

Приобретённый иммунитет, отличие его от наследственного (видового, врождённого). Виды приобретённого иммунитета.

Задача. В семье заболел дифтерией ребенок Валерий, трёх лет. Другие члены семьи не заболели, причём мать переболела дифтерией в детстве, а отец был привит дифтерийным анатоксином. Старшая сестра Наташа, пяти лет, в своё время не была привита дифтерийным анатоксином из-за медицинских противопоказаний, поэтому пришлось провести ей экстренную профилактику с помощью противодифтерийной антитоксической сыворотки. Младший брат, Виталий, трёх месяцев, не заболел, хотя ничем не был привит. В доме есть кошка и собака, они не заболели. Назовите для каждого из членов семьи и для животных вид иммунитета, благодаря которому они не заболели.

Что такое антиген? Какие вещества могут быть антигенами? Полноценные антигены и гаптены, чем они отличаются друг от друга? Структура антигена. Как называется часть молекулы антигена, определяющая его специфичность? Назовите известные Вам антигены. Что такое аутоантигены? Антигенное строение микробной клетки. Жгутиковые и соматические антигены; локализация, буквенное обозначение, химическая природа, отношение к температуре, способ получения, практическое применение. Анатоксин, его свойства, применение, получение. Какая ткань составляет иммунную систему организма? Укажите центральные и периферические органы иммунной системы человека. Опишите процесс формирования гуморального и клеточного иммунного ответа. Укажите клетки, которые осуществляют захват и переваривание антигена; клетки, которые взаимодействуют при формировании гуморального иммунитета, клеточного иммунитета; клетки, которые трансформируются и превращаются в плазмоциты, продуцирующие антитела; клетки, стимулирующие этот процесс; клетки, которые угнетают иммунный ответ; клетки, которые убивают опухолевые клетки, и заражённые вирусом клетки. Что такое антитела? Как получить иммунную сыворотку? Как получить сыворотку, которая бы нейтрализовала столбнячный токсин? Против каких антигенов образуются антитоксины, агглютинины, гемолизины? Какие антитела образуются при введении в организм дифтерийного анатоксина? дифтерийных бактерий? Химическая природа и структура антител. Что такое активный центр иммуноглобулина? Перечислите классы иммуноглобулинов, их свойства. Укажите класс иммуноглобулинов, способных проникать через плаценту. К какому классу относятся секреторные иммуноглобулины? Динамика накопления антител. Чем отличается вторичный иммунный ответ от первичного? Как в практической медицине используются знания о динамике иммунного ответа? Что такое реакции иммунитета, каков их механизм, фазы реакции. В каких 2-х направлениях используют реакции иммунитета? Перечислите реакции иммунитета.

Задача. Поставьте вместо пропущенных слов «анатоксин» или «антитоксин»: _________ является антигеном, _________ является антителом, __________ создаёт при введении в организм активный иммунитет, __________ создаёт при введении в организм пассивный иммунитет, __________ получают путём иммунизации животных, ___________ получают из токсина при воздействии формалином и теплом, ___________ нейтрализует токсины, __________ вызывает в организме образование антител.

Реакция агглютинации: что такое агглютинация, что является антигеном, что - антителом; методы постановки, какие контроли ставятся и для чего; как должны выглядеть контроли. Агглютинирующие сыворотки, что они содержат, как их получают, для чего применяются; что такое титр агглютинирующей сыворотки? Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации: что служит антигеном в этой реакции, как его получают, механизм реакции. Что такое эритроцитарный диагностикум? Что такое антительный эритроцитарный диагностикум? Реакции преципитации: что такое преципитация, что служит антигеном; как получить преципитирующую сыворотку? Что такое титр преципитирующей сыворотки? Методы постановки, практическое применение.

Реакция связывания комплемента (РСК): принцип РСК; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат? Методика постановки РСК. Почему исследуемую сыворотку надо инактивировать? Гемолитическая сыворотка: что содержит, как ее получают, что такое титр и как его определяют? Комплемент: химическая природа, отношение к высокой температуре, где содержится? Как можно разрушить комплемент? Что практически применяется в качестве комплемента?

Задача. На одежде человека, обвиняемого в убийстве, обнаружено пятно крови. С помощью какой реакции можно определить, человеческая ли это кровь; что в этой реакции будет антигеном, и что антителами; какой диагностический препарат нужно иметь в лаборатории для этой реакции, как его приготовляют?

Задача. Как при помощи реакции преципитации определить, является ли доставленный для анализа образец мяса крупного рогатого скота или мясом лошади; какие необходимы диагностические препараты?

Реакция преципитации в агаровом геле, способы постановки, практическое применение.

Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная двухэтапная серологическая реакция. В ней используют пять ингредиентов, составля­ющих две системы: антиген, антитело, комплемент (первая система); эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащей специфические к ним антитела (вторая, или индикаторная, гемсистема). При этом взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, который адсорбирует комплемент, но визуально обнаружить это невозможно. В качестве индикатора связывания комплемента на комплексе антиген–антитело на втором этапе используют гемсистему, кото­рая, являясь иммунным комплексом, тоже способна адсорбировать его. В конечном итоге возможны два вариан­та результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу и комплемент адсорбируется образовав­шимся комплексом, лизиса эритроци­тов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену, и наоборот, комплемент, оставаясь сво­бодным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз.

Как и другие серологические ре­акции, РСК можно использовать для выявления специфических антител по известному антигену или для определе­ния антигена по известным антителам.

Общая характеристика ингредиен­тов РСК.

1. ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА перед постановкой реакции прогрева­ется на водяной бане 30 мин для инактивации ее собственного комплемента и разводится начиная с 1:5.

2. АНТИГЕНОМ могут быть культуры бактерий, их лизаты, вирусы и вирус–содержащие материалы, экстракты па­тологически измененных органов и тканевые липиды.

3. КОМПЛЕМЕНТ – сыворотка мор­ских свинок, полученная в день опыта. В настоящее время используется производственный сухой комплемент.

4. ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин.

Постановка основного опыта РСК. В 1 пробирку вносят СЫВОРОТКУ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ, во вторую – сыворотку, комплемент и вместо антигена изотонический раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ), в третью – антиген, комплемент и тот же раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ АНТИГЕНА). Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 1ч. Одновременно готовят гемолитическую систему, которую затем добавляют во все три пробирки после извле­чения штатива из термостата. Смешав гемсистему с ингредиентами трех пробирок, последние вновь ставят в термостат на 1 ч, и спустя это время учитывают результаты РСК.

При учете РСК интенсивность реакции обозначается плюсами: «++++»– резко положительная реакция с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели на дно; «+++», «++» –положительная реакция, отличается нарастанием окраски жид­кости вследствие гемолиза и уменьшения количества эритроцитов в осад­ке; «+» – слабоположительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов. Отрицательная реакция обозначается знаком «–», при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно–розовую окраску («лаковая кровь»).

РСК – весьма сложная, но очень чувствительная специфическая реакция. Широко применяется в диагностике сифилиса, хронической формы гонореи, коклюша, актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.

Иммуноферментный анализ.

Метод был разработан в начале 70-х гг независимо друг от друга тремя группами учёных. Метод напоминает РИА, но в его основу положено маркирование Аг или Ат, вступающего в реакцию, ферментом. Взд метки с субстратом обычно сопровождается изменением окраски среды. В настоящее время созданы многочисленные модификации этого метода, но наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный). Различают:

1) ПРЯМОЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА. В этом случае:

1. сыворотку с Ат инкубируют с Аг, фиксированным на твёрдом субстрате (чаще всего это пластиковая микропланшетка).

2. Ат, не связавшие Аг, удаляют многократным промыванием.

3. Вносят меченную ферментом сыворотку к Ат, связавшим Аг.

4. Определяют ко-во фермента–маркёра, связавшегося с Ат.

2) КОНКУРЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА.

1. Вносят сыворотку. Если в ней есть специфические Ат, то они связываются с Аг, фиксированном на твёрдом субстрате. Если специфических Ат нет, то Аг оказывается не связанным.

2. При добавлении специфических к фиксированному Аг Антител в первом случае им будет не с чем взаимодействовать (большинство Аг уже связаны) Þ содержание маркёра низкое. Во втором случае специфические Ат будут связываться с Аг и при отмывании они не будут смываться Þ высокое содержание маркёра.

Аналогично м.б. фиксированы АНТИТЕЛА, и различные фирмы выпускают именно планшеты с уже фиксированными Ат.

По сравнению с классическими методами выявления Аг этот метод позволяет непосредственно регистрировать их взаимодействие с Ат, а не вторичные проявления (агглютинацию, преципитацию или гемолиз). Метод очень ЧУВСТВИТЕЛЕН (достаточно концентрации 1нг/мл).

Определяют: Хламидии, клостридии, ВИЧ и др.

8. Реакция фагоцитоза.

Фагоцитоз осущ-ся микрофагами и макрофагами. Стадии фагоцитоза: приближение, прилипание, погружение, переваривание.

Оценка функциональной активности фагоцитирующих клеток.

Колич. оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов производят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром 1,0-2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием бактерий или дрожжеподобных грибов.

Фагоциты смешивают с фагоцитируемым материалом в соотношении 1:10 или 1:100 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем пробирки центрифугируют и осадок ресуспензируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка. В мазках, фиксированных краской Май-Чрюнвальда и окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток (ФП – фагоцитарный показатель) и кол-во поглощенных частиц на 1 клетку (ФЧ – фагоцитарное число).

У здорового человека ФП=40-80%, ФЧ=1-5.

9. Диагностикумы.

Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий. Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37 0 С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в опре-деленном титре сыворотки, который служит диагностическим. Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туля-ремии -1:100. Для выявления антител можно ставить экспрессные реак-ции агглютинации (время учета несколько минут). Например: 1. Кровяно-капельная реакция при туляремии. В каплю цельной крови больного на специальном стекле наносят кап-лю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляре-мийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2 минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков. 2. На стекле проводится экспрессная реакция агглютина-ции по Хеддельсону при бруцеллезе.

Данные реакции не позволяют определить количество ан-тител в сыворотке.б) для идентификации чистой культуры возбудителей ин-фекционных болезней. С этой целью используются иммунные диагностические

агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтамивакцин и сывороток, путем иммунизации животных целымимикробными клетками. Для достоверности сыворотки лучше использовать адсор-бированные, чтобы в них содержались только антитела, соот-ветствующие определенному виду или типу микроорганизма.

Принципы получения иммунных сывороток.

Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену. В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами.

В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, - их высокая специфичность и достаточное содержание антител. По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические - к одному конкретному антигену. Получить моноспецифические сыворотки можно:

1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены,

2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности.

Для этого используют:

1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ -АТ и выделением антител;

2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные анти-

тела. Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой)