Методы диагностики грибковых заболеваний. Диагностика и лечение микозов кожи и ногтей

23.06.2020

Содержание

Выявить поражение и определить возбудителя при поражении грибка на первых этапах крайне сложно. Диагностирование осложнено тем, что патология сразу никак не проявляется или имеет разнообразную симптоматику. Для определения возбудителя берут биоматериал с того участка, который поразила патогенная микрофлора: мокроту, часть кожи, зараженный ноготь, кровь, биопсию лимфоузлов или внутренних органов.

Что такое грибковые заболевания

Как выглядит

Причиной обращения к дерматологу становятся, как правило, первые патологические проявления болезни. Клинические признаки будут отличаться в зависимости от места заражения, возбудителя грибкового заболевания. Выделяют следующие типы патогенных микроорганизмов:

грибок Кандида (Candida) – вызывает кандидозные инфекции;
Трихофитии (Trichophyton) – провоцирует инфекционные патологии ногтей, кожи, слизистых оболочек;
Криптококкоз – атакует внутренние органы, легкие;
Аспергиллез – грибковое заболевание, вызванное снижением иммунитета.

При диагностике может быть определена одна из 2 групп инфекции по локализации:

Проникает патогенная микрофлора через ранки на поверхности эпидермиса, микротравмы, причиной заболевания может стать любая царапина, которая спровоцирует микоз гладкой кожи. Не справляется организм с атакой возбудителя при снижении защитных функций. При диагностике часто определяют заражение родом трихофитон или Кандида. Последние вызывают такие заболевания:

молочница;
кандидоз у мужчин;
кандидоз ротовой полости.

Существует более нескольких десятков возбудителей, их делят по методу поражения тканей. При диагностике могут выявить следующие виды грибковых микроорганизмов:

глубокие системные микозы провоцирует Histoplasma capsulatum;
субкутанные подкожные микозы вызывает Sportrichum schenckii;
эпидермомикозы развиваются из-за Epidermophyton floccosum;
отрубевидный лишай, поверхностный микоз - Malassezia furfur;
оппортунистические грибковые заболевания - Candida albicans.

Классификация микозов

Общее название всех болезней этого типа скрывает под собой разные виды поражения организма человека грибами. При диагностике врачи разделяют заболевания кожи на 4 группы:

Кератомикозы. Местом локализации становится роговой слой эпидермиса, в других слоях кожи воспалительные явления отсутствуют (пьедра, разноцветный лишай, парша, споротрихоз). Вызывают эту разновидность патологии следующие грибы: Sporotrichium, Trichosporon, Piedraia, Exophiala, Pityrosporum.
Дерматомикозы. Характеризуются выраженным воспалительным процессом, локализуются на коже, волосистой части головы, на ногтях (фаус, трихофития, эпидермофития, микроспория). Провоцируют патологии следующие штаммы грибов: Epidermophyton, Microsporum, Trichophyton.
Кандидамикозы. Затрагивает этот вид грибков слизистые оболочки, кожу и ее придатки. Часто объектом атаки грибков рода Кандида становятся внутренние органы.
Глубокие микозы. Провоцируют тяжелые заражения всех слоев кожи, внутренних органов, слизистых оболочек, костей, мышц (мукороз, пенициллиоз, аспергиллез).

Выделяют отдельно псевдомикозы (актиномикоз, эритразма), которые не являются заболеваниями грибкового типа, но по симптомам схожи с истинными микозами. В этих случаях обязательно нужна дифференциальная диагностика. Диагностика в таких случаях очень важна, потому что помогает определить тип грибкового поражения или исключить его. От этого зависит назначения схемы лечения, ее длительность и эффективность.

Дерматомикозы

Грибки-дерматофиты глубокого проникаются в кожу, провоцируют дерматомикозы, к примеру, следующие известные патологии:

микроспория;
трихофития;
эпидермофития;
руброфития;
фавус.

Относят этот вид патологии к разным болезням, которые создают рубцовые изменения, деформацию кистей рук, ногтей стоп, изменение структуры и выпадение волос. Поражают возбудители верхние, глубокие слои кожи, что приводит к появлению фурункулоподобных узлов, пустулезных высыпаний, обширных очагов воспаления. Для развития благоприятным условием становится нарушение гигиены стоп. Сначала грибок растет на коже ног, в межпальцевых промежутках, затем переходит на ногти.

Кандидозы

Патогенные микроорганизмы поражают глубокие и поверхностные слои кожи, распространяются на ногти, волосы, внутренние органы. Вызывают болезни грибы рода Кандида, болезни относятся к группе кандидамикозов. Выделяют следующие типы этих недугов:

генерализованные;
поверхностные;
висцеральные.

Относятся грибы Candida к условно-патогенным. Дрожжеподобные возбудители можно обнаружить при диагностике в кишечнике, ротовой полости и у здорового человека. Сдерживает распространение патогенных микроорганизмов сильный иммунитет, а при его ослаблении начинается активное размножение кандид, что приводит к поражению кожного покрова туловища, ступней, головы, кистей. Клинические изменения отмечаются при всех типах кандидамикозов. Лечение зависит от тяжести течения, вида поражения.

Глубокий микоз

Это вид заболеваний, которые затрагивают глубокие слои кожи, внутренние органы. Болезни развиваются при сильном снижении защитных сил организма, изменении гормонального фона, нарушении обмена веществ. Относят следующие патологии к глубоким микозам:

кокцидиоидоз;
хромомикоз;
риноспоридиоз;
гистоплазмоз;
споротрихоз;
бластомикоз;
мукороз;
цефалоспориоз;
мицетома;
кладоспориоз;
мадурская стопа;
аспергиллез.

Кератомикоз

Это группа патологий, которые локализуются только на кутикулах волос, роговом, поверхностном слое кожи. Характерным признаком кератомикоза становится отсутствие воспалительных явлений. Возбудителями болезни являются плесневелые, дрожжеподобные грибы, дерматофиты (около 70 видов патогенов). Провоцируют они следующие заболевания:

шимбери;
белый лишай;
черный лишай;
черепицеобразный микоз;
тропический белый и желтый лишай;
узловатая трихоспория;
пьедра;
разноцветный (отрубевидный) лишай.

Как диагностировать грибок

Далее начинается визуальный осмотр, который помогает определить масштабность поражения, какие участки поверглись воздействию грибков. Врач должен обратить внимание на наличие иммунодефицитного состояния пациента. Для определения типа возбудителя необходимо сделать забор материала, который отправляют на лабораторное исследование. Опытный врач может при первичном осмотре поставить диагноз, но для составления схемы терапии нужно все равно провести изучение биоматериала. Для диагностики грибковых заболеваний применяют следующие методы:

микроскопия – исследование под микроскопом биоматериала, распространенный и простой метод диагностики;
исследование под лампой Вуда – специальный спектр ультрафиолетового освещения (люминесценция) помогает заметить грибковые поражения;
бактериологический посев – точный способ диагностики, но проведение его занимает 2-3 недели, пока не вырастет колония на питательной среде;
ПЦР-диагностика – самый точный способ определения вида патогенной микрофлоры, но для точного диагноза может потребоваться проведение нескольких анализов, что требует траты денег.

Лабораторные методы

Только своевременный точно поставленный диагноз поможет назначить эффективную схему терапии и сократить длительность курса. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний является самым эффективным методом для определения типа возбудителя. Для выявления используют такие варианты исследования:

бактериологический посев;
гистологический анализ;
ПЦР-диагностирование;
иммунологическое исследование;
микробиологические исследования;
культкуральное исследование.

Дифференциальная диагностика микозов

Постановку точного диагноза затрудняет то, что при разных видах микоза появляются различные симптомы. В таких случаях используют дифференциальный метод диагностики, сравнивают с другими дерматологическими патологиями микоз. Часто признаки микоза путают с псориазом, но при соскабливании чешуек грибковая патология не будет кровоточить. Схожая симптоматика наблюдается и с парапсориазом.

Врач должен исключить вероятность развития нуммулярной экземы. Это особый вид патологии, который можно выявить только при лабораторной диагностике. Часто признаки грибка принимают за полиморфный фотодерматоз, который может развиваться только у взрослого человека и никогда не встречается у ребенка. Лабораторная и дифференциальная диагностика обязательна для постановки точного диагноза, назначения грамотного лечения.

Микробиологическая диагностика микозов

Это самый простой и распространенный метод выявления микоза на коже и в крови. Для точного диагноза необходимо собрать материал для исследования. При поражении волосистой части головы нужно при помощи пинцета собрать пораженные волосы, а с кожи сделать соскоб поврежденного участка. Лабораторные исследования при грибковых заболеваниях по микробиологическому методу проводятся при помещении биоматериала в раствор гидроксида калия 30%, потом на предметное стекло.

Анализ поможет вывить, где расположен грибок (снаружи или внутри кожи, волоса), его размеры. Если забор материала провести неверно, то анализ может дать ошибочный результат. Используют для диагностики следующие методы микробиологической диагностики:

микроскопия с нативными и неокрашенными препаратами;
микроскопия с окрашенными препаратами.

Методы исследования

При диагностике специалист должен учитывать структуру мицелия (строение гиф, их септированность, цвет), особенности строения спор, кондиев, учитывается их цвет, форма и размер, строение клеточной стенки и т.д. Для исследования готовят нативные, окрашенные препараты. Последние требуют обработки материала разными способами:

PAS-окрашивание. Окраска такого типа помогает определить в стенках микроорганизмов нейтральные полисахариды. К ним относится глюкан-маннановый комплекс, который находится в клеточной стенке многих эумицетов. Он и провоцирует процесс окрашивания.
PAS-реакция. Используется для диагностики грибковой инфекции тканевой формы. В лаборатории применяют для этого исследования разные модификации, к примеру, окраска по Гридли или реакция Бауэра.
Метод Грама. Окраска этим способом помогает выявить наличие сопутствующих микрорганизмов.
Окраска по Циль-Нильсону. Помогает определить кислотоустойчивые микроорганизмы. Если биоматериал жидкий, то готовят специальный неокрашенный мазок в просветляющих жидкостях для микроскопии: в равных пропорциях смешивают глицерин и спирт.

Культуральное исследование на грибы

Помещают посев биоматериала на питательную среду (выращивание), чтобы выделить чистую культуру при комнатной температуре. Диморфные грибы в таких условиях образуют мицелий, при росте до 37 градусов начинают формироваться дрожжеподобные клетки. Среда Сабуро применяется для дерматофитов и грибов Candida, для плесневелых (гифальных) необходима среда Чапека. Часто добавляют в состав антибиотик. Глубокие микозы могут определить только в клинико-лабораторных центрах из-за высокой контагиозности.

Люминесцентная диагностика грибковых заболеваний

Для определения пораженных участков кожи патогенной микрофлорой рода Микроспорум используют ультрафиолетовую лампу. Это вариант экспресс-диагностики, которая применяется при необходимости подтвердить наличие кожной инфекции, симптомы лишайных заболеваний. Ультрафиолетовое излучение не является главным способом определения грибка, это вспомогательный метод, поэтому выполнять его не обязательно.

Для осмотра больного используют лампу Вуда, они испускает УФ излучения, под их действием продукты жизнедеятельности грибка светятся ярким светом. Цвет зависит от того, какой вид возбудителя поразил пациента:

зеленоватый – лишай волосистой части головы;
голубой – красная волчанка на губах;
желтоватый – плоские лишайные образования.

Иммунологический ферментный анализ крови на грибок

Для обнаружения микозов, поразивших кожные покровы, внутренние органы (гистоплазмоз, кокцидиоидоз) используют иммунологический ферментный анализ крови на грибковые заболевания. Часто используют эту методику в случае, если взять биопсию тканей для изучения по определенным причинам не получается. Основывается методика на поиск титра антител к конкретному типу грибкового заболевания.

Для этих целей используют определение IgG к аспергиллезу, кандидозу. Точность анализа составляет около 80%, в редких случаях можно получить ложноположительный результат при отсутствии глубоких микозов. Случается это при наличии у больного грибка слизистой оболочки рта или запущенной формы молочницы. Для ИФА требуется забор венозной крови, берут его утром рано или, спустя 4 часа после последнего приема пищи. Другой подготовки для проведения анализа не требуется.

Ответ на анализ будет через несколько суток после забора биоматериала. Редко длительность ожидания превышает 5 дней. Влияет на скорость проведения исследования качество оборудования в лаборатории, если есть причины провести дополнительное изучение образцов крови. Пациенту выдают по завершении процедуры заключение, где будет указано одно из значений:

при подтверждении наличия грибка будет написано «положительный результат»;
при отсутствии полной уверенности, что был обнаружен грибок в крови, пишут «сомнительный результат»;
при отсутствии патогенной микрофлоры в образце биоматериала пишут «отрицательный результат»;
при наличии хорошего оборудования при исследовании крови могут определить концентрацию клеток микоза и указать показатель в заключение.

ПЦР-диагностика грибковых заболеваний

Самым точным и достоверным способом диагностики грибка и других инфекционных заболеваний является полиразмерная цепная реакция. Обладает метод диагностики следующими преимуществами:

низкая стоимость анализа;
высокая точность;
исследование биоматериала проводится быстро;
для анализа можно собрать любой образец тканей (частичку кожи, слизистой, соскоб с подошвы стоп, пальцев рук, поверхности ногтей, волосы, кровь).

Главный недостаток этого исследования – узкая направленность. Чтобы диагностировать микоз, нужно точно знать, где он поразил организм человека. ПЦР определяет тип возбудителя, концентрацию в организме больного. Результаты будут известны через сутки, в некоторых случаях (при отсутствии неблагоприятных условий), ответы приходят в день сдачи (через 5-6 часов). Скорость выполнения исследования зависит от правильности забора образца, опытности медперсонала, загруженности работой лаборатории.

Как определить грибок в домашних условиях

При умении распознать симптоматику микозных патологий и применении домашних методов диагностирования, можно определить вид патогена. Пациент должен правильно оценить течение болезни, можно на первых этапах грибковое заболевание спутать с псориазом или лишаем. Чтобы этого избежать, нужно знать основные признаки микоза, которые отличают его от других недугов. Симптомы поражения грибком:

ногти становятся желтого цвета, начинают слоиться;
изменение формы ногтевой пластины;
нет периодов ремиссии и обострения, начинается полное отслоение пластины, что не происходит при кожных патологиях и псориазе;
место поражения имеет неприятный запах, болит при прикосновенно, появляется зуд, шелушение, могут образовываться бляшки на поверхности кожи;
поражает грибок, как правило, межпальцевые промежутки на одной или обеих ногах, затем недуг распространяется на ноготь и остальную ступню.

Диагностика грибка ногтей на ногах с помощью перманганата калия

Если вы заметили, что ногти на руках, ногах начали видоизменяться, появился неприятный запах, то можно прямо дома проверить наличие или отсутствие инфекции. Вам понадобится для проведения анализа марганец, теплая вода и емкость. Процедура проводится следующим образом:

при наличии признаков кожного заболевания нанести тонким слоем йод на этот участок;
подождите 2 минуты;
если проблема есть, то очаги поражения примут насыщенный окрас;
здоровые участки кожи выделять не будут.

Сколько стоит диагностика грибковых заболеваний в клиниках Москвы

Название	Вид исследования	Цена, рублей
	Микроскопическое исследование проб ногтей
	Микроскопия и посев (кожа/ногти)
	Посев на дрожжеподобные грибы
Мед. центр «Академия здоровья»	Микроскопическое исследование соскоб ногтей
	Микроскопическое исследование соскоб кожи
	Микроскопическое исследование волос
	Соскоб, анализ на вирусные инфекции.
«Медлайн Сервис»	Анализ крови на Candida (ДНК)

Видео

Внимание! Информация, представленная в статье, носит ознакомительный характер. Материалы статьи не призывают к самостоятельному лечению. Только квалифицированный врач может поставить диагноз и дать рекомендации по лечению, исходя из индивидуальных особенностей конкретного пациента.

Нашли в тексте ошибку? Выделите её, нажмите Ctrl + Enter и мы всё исправим!

2. Лабораторное исследование патологического материала

2.1. Микроскопические исследования

Для обнаружения морфологических элементов гриба - дрожжевых клеток, псевдомицелия, мицелия, конидиеносцев, конидий, тканевых форм глубоких микозов - патологический материал исследуют в нативных и окрашенных препаратах.

Жидкий патологический материал просматривают в неокрашенном состоянии в следующих просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином (этиловый спирт 1 ч., глицерин 2 ч., дистиллированная вода 2 ч.), раствор Люголя (1 г кристаллического йода, 2 г калия йодида, 150 мл воды), а также в воде или физиологическом растворе. Для приготовления нативных препаратов на предметное стекло петлей или пипеткой наносят каплю материала, затем 1-2 капли просветляющей жидкости, накрывают покровным стеклом и микроскопируют при малом увеличении 1:80 (окуляр 10х и объектив 8х), при котором можно видеть скопления дрожжевых клеток, псевдомицелий, мицелий и другие элементы грибов. При большом увеличении 1:400, можно характеризовать отдельные клетки.

Плотный патологический материал (кожные, ногтевые чешуйки) помещают в каплю 10-20% раствора КОН, слегка подогревают над пламенем горелки (для лучшей мацерации) до появления кристалликов щелочи по периферии капли. Затем каплю накрывают покровным стеклом, слегка надавливают на него и микроскопируют, вначале под малым увеличением для нахождения чешуйки, далее при большом увеличении.

В материале из волос мантия из окружающих волос спор (эктотрикс) или внутри волоса (эндотрикс) элементы гриба обычно очень четко видны. Поражения волос, как и размеры спор, специфичны для различных видов дерматофитов. Необходима дифференциальная диагностика между структурами гриба и артефактами. Возможными источниками ложноположительных результатов являются липидные капли, пузырьки воздуха, волокна текстиля и так называемый “мозаичный гриб”. Липидные капли могут быть похожи на дрожжевые клетки – такие находки наиболее часты в плохо просветленном материале. Волокна текстиля обычно лежат отдельно от материала эпидермиса, волос или ногтя. Они крупнее, чем гифы гриба, неравномерной толщины и не содержат септ. “Мозаичный гриб” – это артефакт, полученный в процессе кристаллизации КОН при чрезмерном нагревании препаратов. В отличие от грибов, четких разделений на клетки не определяется.

Важным этапом диагностики грибковых инфекций является приготовление окрашенных препаратов. Любой патологический материал (мазковые препараты, отпечатки органов, центрифугаты и, конечно, гистологические срезы) должны пройти три основных вида обработки: 1) окраска PAS-методом для выявления истинных грибов – эумицетов; 2) окраска по методу Грама или в модификациях по Грам-Вайгерту, по Боголепову, по Браун-Бренна – для выявления сопутствующей бактериальной микробиоты, для выявления актиномицетов и нокардий; 3) окраска по методу Циль-Нильсона или модификация по методу Киньона – для выявления кислотоупорных микроорганизмов, прежде всего, для индикации и дифференцировки с микобактериями туберкулеза, для обнаружения возбудителей проказы, нокардий и спорообразующих дрожжей.

PAS-метод (Шифф-йодная кислота) предполагает выявление в стенках микроорганизмов нейтральных полисахаридов. В стенках большинства эумицетов имеется в той или иной концентрации глюкан-маннановый комплекс, за счет чего и происходит окрашивание.

Прокариоты (бактерии) оказываются РАS–отрицательными, в том числе интересующие миколога актиномицеты и нокардии. Однако при формировании актиномикотических друз образуется так называемый “цемент”, склеивающий вегетирующий актиномикотический мицелий в гранулу, который также дает РАS-положительную окраску. В связи с чем, этот метод применим и при диагностике актиномикоза.

РАS-реакция (и ее модификация) является важнейшим методом диагностики тканевых форм грибковой инфекции. Метод основан на окислении гликолиевых групп углеводов йодной или хромовой кислотой. Йодная кислота окисляет 1,2 и 1,4 гликоли в альдегиды и разъединяет связи между носящими гидроксильные группы углеродными атомами. Альдегидные группы могут быть обнаружены и при помощи альдегидного реактива Шиффа. In situ в стенках гриба происходит интенсивное окрашивание гетерополисахаридного комплекса в пурпурно-красный цвет (методика – см. приложения).

Для подавления окраски окружающих тканей применяется обработка (“контрокраска”) световым зеленым, метаниловым желтым и т.п. В этом случае выявляются только грибные клетки, что весьма полезно на стадии индикации возбудителя в тканях или в мазковых препаратах. В то же время, судить об ответной реакции организма и альтерации тканей на таких препаратах не представляется возможным. Всегда необходимо иметь параллельные препараты, окрашенные РАS-методом с докраской гематоксилином.

На практике применяется не только РАS-метод в классическом варианте, но и его различные модификации: окисление хромовой кислотой (вместо йодной) – это реакция Бауэра, окраска по Гридли, импрегнация метенаминсеребром по методу Гомори-Грокотт. Все они успешно используются для обнаружения тканевых форм грибов, и в основе их лежит один и тот же принцип (техника – см.приложение). Табл.3.

Таблица 3

Тинкториальные свойства тканевых форм грибов

(в патологическом материале, в гистологических срезах)

Оппортунистические микозы	Методы выявления
Кандидоз	РАS или окраска по методу Гридли
Аспергиллез	Гематоксилин и эозин, импрегнация по Гомори-Грокотт
Зигомикоз	Гематоксилин и эозин
Криптококкоз	Альциановый синий (по методу Моури) + РАS-реакция + гематоксилин
Пневмоцистоз	Окраска по методу Бауэра, импрегнация по Гомори-Грокотт, окраска тионином
Фузариоз	Окраска по методу Романовского-Гимзы, по методу Райта
Сцедоспориоз
Трихоспороз	Гематоксилин и эозин, окраска по методу Романовского-Гимзы
Феогифомикозы и хромомикоз	Гематоксилин и эозин
Первично-патогенные микозы:	Методы выявления
Кокцидиоидоз	РАS –реакция + гематоксилин
Гистоплазмоз	импрегнация по Гомори-Грокотт, окраска по методу Бауэра, окраска по методу Романовского-Гимзы
Североамериканский бластомикоз
Паракокцидиодоз	РАS –реакция, импрегнация по Гомори-Грокотт
Адиаспиромикоз	Гематоксилин и эозин, РАS-реакция
Псевдомикозы:	Методы выявления
Актиномикоз	Гематоксилин и эозин, окраска по методу Грам-Вейгерту
Нокардиоз	окраска по методу Циль-Нильсена, по методу Киньона, по методу Грама.

При предположении диагноза “криптококкоз” целесообразно применять методы специфического выявления капсульного материала Cr.neoformans , содержащего гликозаминогликаны (кислые полисахариды). Для этой цели используется окраска альциановым синим (по методу Моури), основным коричневым (по методу Шубича), окраска муцикармином. Очень полезна тройная окраска: РАS-реакция, затем обработка альциановым синим, затем гематоксилином. В этом случае становится возможной дифференцировка между криптококками и тканевыми формами других грибов, имеющих сходную морфологию.

Описание патологического материала (гистологических препаратов) включает данные о морфологии и размерах тканевых форм грибов, их тинкториальной характеристике, отношении к тканям хозяина, наличии фагоцитоза, определении сопутствующей микробиоты.

2.2. Посев патологического материала и количественный учет клеток при микозах, вызванных дрожжевыми грибами

Получение культур грибов необходимо для их идентификации и определения чувствительности к антифунгальным препаратам.

МОКРОТУ перед исследованием 5-10 мин гомогенизируют встряхиванием со стерильными бусами. Если мокрота содержит много слизи и плохо гомогенизируется, к ней можно добавить 1-2 мл стерильного физиологического раствора. Мокроту микроскопируют в нативных или окрашенных препаратах. Если при микроскопии мокроты с большим увеличением в поле зрения видны элементы гриба, то ее следует сеять в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000, если элементы гриба не обнаруживаются, мокроту сеют не разведенную. Разведения готовят в жидкой питательной среде (сусло, Сабуро, 1% пептонная вода) или в стерильном физиологическом растворе. Из каждого разведения посев производят по 0,1 мл с помощью шпателя на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА с добавлением антибактериальных антибиотиков – пенициллина и стрептомицина, биомицина (100-200 ед./мл среды). Питательную среду предварительно подсушивают в термостате при +37 С, т.к. при наличии конденсата рост колоний может иметь сливной характер. Посевы инкубируют в термостате при + 37 о С в течение 48 ч. Затем при наличии роста однотипных дрожжевых колоний производят их количественный учет. Расчет численности дрожжевых клеток (n) в 1 мл или 1 г исследуемого материала производят по формуле n = авс, где а - среднее число колоний на одной чашке Петри, в = 10 при объеме посевного материала 0,1 мл, с- степень разведения экскрета (10,100,1000).

Пример расчета: на чашках с разведением 1:1000 выросло в среднем 60 колоний, при этом в 1 мл исследуемого экскрета содержится 60 х 10 х 1000=600000 дрожжевых клеток.

БАЛ, ПРОМЫВНАЯ жидкость бронхов, гайморовых полостей, желчь (порции А,В,С), желудочный сок, дуоденальное содержимое, мочу переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10-15 мин, после чего надосадочную жидкость быстрым движением сливают. Из осадка готовят нативные препараты для микроскопии. Если при микроскопии дрожжевые клетки обнаруживаются в каждом поле зрения, то посев производят в разведениях 1:100 и 1:1000 по 0,1 мл на плотные питательные среды и инкубируют при 37 С 48 ч. Если при микроскопии осадка дрожжевые клетки не обнаруживаются, осадок засевают без разведения. Количество дрожжевой флоры рассчитывают на 1 мл патологического материала.

ФЕКАЛИИ забирают мерной ложкой в количестве 0,2 г, помещают в1,8 мл жидкого сусла и тщательно размешивают стеклянной палочкой. Полученное разведение (1:10) отстаивают 5-10 мин, готовят разведения 1:100, 1:1000 и засевают в объеме 0,1 мл на 2 чашки Петри с агаризованной средой. Учет количества дрожжевой флоры производят на 1 г фекалий.

ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНАЯ жидкость. Характеризуют ее внешний вид (прозрачная или мутная, бесцветная или окрашенная, наличие примеси крови, осадка). Микроскопируют мазки из осадка ликвора после его центрифугирования. Готовят три препарата: нативный - в капле стерильного физиологического раствора: нативный - в капле туши и мазок для окраски РАS-методом, по Граму и альциановым синим по Моури.

Микроскопия цереброспинальной жидкости в нативных и окрашенных препаратах позволяет установить наличие дрожжевых почкующихся клеток и фрагментов мицелия гриба, либо бактерий, вызывающих гнойный менингит (менингококк, пневмококк, гемофильная палочка и др.). В тушевом препарате может быть выявлен капсульный гриб Cryptococcus neoformans. При этом на сером фоне туши видны почкующиеся дрожжевые клетки, окруженные светлым ореолом капсулы. В тушевых препаратах также могут быть дрожжевые формы Candida albicans , не имеющие светлого ореола капсулы вокруг клетки.

Cr. neoformans может быть также обнаружен с помощью окраски альциановым синим (по Моури). Окраска происходит за счет селективного выявления капсульного гетерополисахарида характерного для Cr.neoformans . При обнаружении в окрашенном по Граму препарате бактериальной флоры дальнейшее исследование цереброспинальной жидкости проводят по соответствующим бактериологическим методикам. После микроскопии осадка производят посев жидкости на 3 чашки свежеприготовленных, подсушенных сусло-агара или агара Сабуро, а также на жидкое сусло или жидкую среду Сабуро. На поверхность питательного агара чашек 1 и 2 наносят 2-3 капли осадка жидкости и тщательно втирают шпателем, а на поверхность агара чашки 3 для обнаружения мицелиальных грибов производят посев по 1 капле в трех точках. Оставшуюся жидкость переносят в 5 мл жидкого сусла или агар Сабуро. Посевы инкубируют при двух температурных режимах: чашку 1 - при +37 о С, а чашки 2 и 3 и посев на жидкой среде - при +28 о С - +30 о С. Посевы при температуре +37 о С просматривают на 2 и 5 день, а при 28 - 30 о С - на 4,7,10 день роста. Если на 5 день при температуре +37 о С и на 10 день при температуре 28-30 о С рост не отмечается, производят высев из жидкой питательной среды на чашки с сусло или агаром Сабуро. В случае отсутствия роста дрожжевой флоры результат посева жидкости регистрируют как отрицательный.

ОТДЕЛЯЕМОЕ свищей. Исследование начинают с микроскопии материала в нативных или окрашенных препаратах. Затем производят посев материала на агаровую среду (сусло или Сабуро), для чего на чашку наносят 2-3 капли отделяемого и шпателем распределяют по поверхности агара. Посевы инкубируют в течение 48 ч при +З7 о С.

ОТДЕЛЯЕМОЕ слизистых.

1. Тампон помещают в пробирку с 2 мл жидкой среды (сусло, Среда Сабуро или МПБ) и встряхивают 5-7 мин, не замочив пробку. Готовят разведения 1:10, 1:100 и высевают по 0,1 мл из каждого разведения на две чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном (для обогащения) инкубируют при температуре +37 С. Через 48 ч подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых клеток, взятых тампоном. Для этого количество выросших дрожжевых колоний умножают на 20 и на разведение. При отсутствии роста колоний на чашках из взятых разведений производят повторный высев из среды обогащения на одну чашку с сусло-агаром.

2. Посев можно делать, проводя тампоном с вращением по поверхности питательной среды. При этом количество дрожжевых колоний не учитывают, а отмечают только наличие и интенсивность роста: единичные колонии, значительный или сплошной рост, отсутствие роста микробиоты.

КРОВЬ. Пробы венозной крови для получения гемокультуры необходимо разбавлять средой обогащения, по крайней мере, 1:5 для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов. Засевают 5-10 мл свежевзятой крови соответственно в 50-100 мл питательной среды (жидкое Сабуро с 2% глюкозы или в среду Китт-Тароцци после ее регенерации). Для посева можно брать кровь с антикоагулянтом (1:10 5% раствора натрия цитрата). Посевы выращивают 10 дней при +37 о С с контрольным высевом на 5 и 10 дни. Стерильной пипеткой берут осадок, 3 капли которого рассевают бактериологической петлей по поверхности сусло-агара в чашки Петри. Засеянные чашки помещают в термостат с температурой +37 о С на 2-5 суток. В случае роста дрожжевой флоры выдают предварительный ответ о наличии гриба в крови, а культуру определяют до рода и вида.

Описан другой метод посева крови на микофлору (H.Rieth). В этом случае посев 5-10 мл крови производят каплями. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри стерильной пипеткой наносят 40-50 капель крови, на расстоянии 0,5 см между каплями. Посев производят на две чашки Петри, инкубируя в одной чашке при температуре +37 о С, а в другой - при комнатной температуре в течение 2-5 дней.

КУСОЧКИ тканей органов. Делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхности плотной питательной среды в чашке Петри, затем производят рассев петлей. Этот же кусочек ткани помещают в 50 мл жидкой питательной среды (сусло, среда Сабуро). Посевы инкубируют в термостате при температуре +37 о С в течение 5 дней.

КОЖНЫЕ и ногтевые чешуйки. Посев чешуек производят независимо от результатов микроскопии. Для этого стерильной микологической лопаточкой, увлажненной в конденсате среды, чешуйки переносят в пробирку на скошенный сусло-агар в 2-3 точки, прижимая их к поверхности среды. В зависимости от количества материала, поступившего на исследование, посев делают в 2-3 пробирки. Посевы инкубируют в термостате при температуре 28-37 о С до 5 дней.

Широко применяются методы быстрой идентификации C.albicans . Этот вид способен образовывать ростковые трубки и короткие нити псевдомицелия в течение нескольких часов (2-4 часа при 37 о С) на сыворотке крови, яичном белке, на среде Игла, на 199 среде и т.п. Практически в лабораториях используется сыворотка человека (остатки от серологических реакций), где при 37 о С образуются ростковые трубки, а через 24 часа клубки псевдомицелия. Для вида C.albicans этот феномен характерен в 90% случаев. Реже образуются ростки у C.tropicalis.

2.3. Микроскопическое исследование и посев патологического материала при подозрении микозов, вызванных плесневыми грибами

Патологический материал может исследоваться в нативных и окрашенных препаратах. Предметные и покровные стекла, предназначенные для приготовления микропрепаратов, должны храниться в смеси спирта с эфиром (1:1) во избежание загрязнения микобиотой воздуха. Перед употреблением предметные и покровные стекла стерилизуют над пламенем горелки.

Микроскопия материала

МИКРОСКОПИЯ мокроты. Для приготовления нативных препаратов мокроту переносят в стерильную чашку Петри и рассматривают на черном фоне для обнаружения мелких частиц (комочков). Комочки могут быть гнойные, гнойно-слизистые, гнойно-кровянистые. Размеры комочков варьируют по величине в пределах 0,3-3 мм в диаметре, цвет их может быть серым, желтоватым, зеленоватым. Для приготовления нативных микропрепаратов отдельные комочки переносят препаравальными иглами или бактериологической петлей в каплю спирта с глицерином, либо в каплю 10% раствора КОН. Накрывают покровным стеклом, слабо надавливают препаровальной иглой и микроскопируют при малом (1:80, окуляр 10 х и объектив 8х) и большом (1:400, окуляр 10х и объектив 40х) увеличениях микроскопа.

Препараты из промывных вод, экссудата, а также желчи, мочи, желудочного сока, ликвора готовят из нативного осадка или из осадка, полученного в результате центрифугирования (при 1500 об/мин в течение 5 мин). Осадок петлей или пастеровской пипеткой переносят в каплю 10% раствора КОН на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и рассматривают при малом и большом увеличениях микроскопа.

Для приготовления окрашенных препаратов исследуемые комочки или каплю осадка равномерно распределяют препаравальными иглами или предметным стеклом меньшего размера по поверхности стерильного предметного стекла до получения тонкого мазка. Полученный мазок подсушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова (равные части 96% этилового спирта и эфира) в течение 3-5 мин, либо троекратным фламбированием над пламенем горелки. Фиксированный мазок окрашивают по Граму, РАS-методом, калькофлюором белым. Окрашенный препарат микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа (1:900, окуляр 10х, объектив 90х).

Посев материала

При исследовании любого патологического материала на мицелиальные грибы его засевают на плотную среду Сабуро или сусло с добавлением пенициллина и стрептомицина (100-200 ед./мл среды). Посев производят в двух повторениях, учитывая различные температурные режимы выращивания мицелиальных грибов (+37 о С и +28 о С), всегда в 3 точки в центре чашки. Время инкубации 4-5 суток.

Мокроту (отобранные комочки) переносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой на поверхность среды Сабуро или сусла. Место посева отмечают карандашом с обратной стороны дна чашки Петри. Засеянные чашки Петри помещают в термостат крышкой вверх.

После определенного срока инкубации засеянные чашки просматривают и при обнаружении спороношения определяют культуру гриба. В случае отсутствия спороношения гриб пересевают на дифференциальную среду Чапека для дальнейшей идентификации.

Осадок промывных вод бронхов, гайморовых полостей, экссудата, мочи, желудочного сока (нативный или после центрифугирования) забирают пипеткой и засевают в объеме 0,1 мл. Фекалии разводят 1:10 (1г фекалий и 9 мл жидкости) в жидкой среде Сабуро или жидком стерильном изотоническом растворе хлорида натрия, эмульгируют, отстаивают 10 мин для осаждения крупных частиц, засевают надосадочную жидкость в объеме 0,1 мл. Отделяемое наружного слухового прохода и зева, взятое тампоном, сеют, тщательно проводя каждой стороной тампона по поверхности питательной среды. Можно засевать смывы с тампонов. Для этого тампоны помещают в 10 мл жидкой среды Сабуро или жидкого сусла со стеклянными бусами и эмульгируют 10 мин, засевают 0,1 мл смыва с тампона газоном (по Лещенко В.М., 1973), либо в три точки.

Кожные и ногтевые чешуйки помещают на поверхность питательной среды, тщательно прижимая их.

Осадок цереброспинальной жидкости (центрифугат при 1500 об/мин в течение 5 мин) сеют на две чашки среды по 0,1 мл, а его остаток засевают в среду обогащения (жидкая среда Сабуро или жидкое сусло), разлитую по пробиркам в объеме 5 мл. Засеянные чашки инкубируют как обычно, а пробирки с посевом на среде обогащения - при + 28 С в течение 10 дней.

В случае наличия роста мицелиального гриба на плотных средах культуру его определяют из этого посева, при отсутствии роста на Сабуро-агаре или сусло-агаре гриб изучают со среды обогащения. Для этого культуру гриба пересевают еще раз на дифференциальную плотную среду Чапека и в дальнейшем идентифицируют.

Из кусочка ткани органа (биопсия, аутопсия) делают отпечаток на поверхность плотной среды надрезанной стороной исследуемого кусочка в трех точках. Одновременно кусочки тканей помещают в 50 мл жидкой питательной среды (Сабуро, сусло).

Кровь исследуют при подозрении на фунгемию в двух - трех повторах. Засевают 5 или 10 мл крови, соответственно в 50 или 100 мл жидкой среды Сабуро с 2 % глюкозы. Посевы выращивают при +37 С и +28 С в течение 10 дней. Первый просмотр посевов проводят через 5 дней, второй - через 10 дней. На пятые сутки можно наблюдать рост мицелиального гриба в виде войлочного комочка на дне и поверхностной пленки. Грибницу пересевают на дифференциальную среду Чапека для определения рода и вида гриба. Если на 5 день рост гриба не отмечается, посевы выдерживают до 10 дней и при отсутствии роста результаты исследования регистрируют как отрицательные.

При посеве на три точки рост гриба в двух и трех точках определяется как диагностически значимый, в одной точке - случайный. При необходимости, возможен повторный посев.

Идентификация выделенных культур плесневых грибов

После выделения культуры мицелиальные грибы пересевают на дифференциальную среду Чапека для родового и, по возможности, видового определения.

В практике диагностических лабораторий, как правило, используют культурально-морфологические критерии идентификации: оценивают характер роста культуры гриба на агаровых средах (культуральная диагностика, макроморфология) и микроморфологию гриба.

В затруднительных случаях используют дополнительные методы диагностики (изучение ферментативной активности, температурных особенностей роста некоторых плесневых грибов).

Понятие макроморфологии (культуральные признаки) включает структуру колонии (пушистая, войлочная, бархатистая, паутинистая, шерстистая, клочковатая, мучнистая и др.), поверхность (плоская, складчатая, бугристая, куполообразная, коремиеформная, зональная и др.), пигментацию колонии гриба и субстрата (различные оттенки зеленого, голубого, фиолетового, черного, серого и др.), наличие экссудата на поверхности колонии.

Микроморфологию гриба из культуры изучают по препаратам, которые в зависимости от родовой принадлежности гриба готовят следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости для приготовления препаратов (равные части спирта, глицерина и воды); в нее помещают кусочек грибницы, вырезанной микологической лопаточкой из колонии в виде треугольника с захватом центральной и периферической частей, двумя препаровальными иглами расправляют вырезанный кусочек с осторожностью во избежание образования пузырей воздуха. В некоторых случаях (мукор и ризопус) при приготовлении препарата грибницу расправляют на сухом предметном стекле, на нее наносят каплю жидкости и накрывают покровным стеклом. Препараты просматривают под микроскопом при малом и большом увеличениях. Изучают субстратный и воздушный мицелий, отмечают наличие или отсутствие септ (перегородок), обращают внимание на характер спороношения: конидиеносцы с конидиями и спорангии со спорангиеспорами.

Конидиеносцы различны по своему строению: от простых одиночных спороносных гиф до ветвистых древовидных образований. Конидиеносцы располагаются поодиночке либо группами, они заметно отличаются от вегетативных гиф мицелия, бесцветные или окрашенные, приподнимающиеся, прямостоящие, ниспадающие, стелющиеся. Они могут состоять из одной клетки и из большого количества разных по форме и величине клеток, каждая из которых имеет свое наименование. Например, у рода Aspergillus конидиеносец состоит из следующих клеток: ножки, пузыревидного вздутия, стеригм, цепочек конидий. У рода Penicillium конидиеносец имеет форму простых или сложных кисточек, состоящих также из различных клеток: веточек-рами, метул, фиалид, цепочек конидий.

У плесневых грибов Mucor и Rhizopus спороношение в виде спорангиев с эндоспорангиоспорами. Спорангий находится на конце спорангиеносца. Спорангии шаровидной или грушевидной формы, у большинства с особой колонкой, являющейся продолжением спорангиеносца внутрь спорангия. Спорангиеспоры округлые, бесцветные или окрашенные.

Конидии (споры) у плесневых грибов полиморфные (цилиндрические, шаровидные, овальные, эллипсоидные, яйцевидные, грушевидные, булавовидные) одно- и многоклеточные, варьируют по размеру и окраске, одиночные, цепочками или собраны в головки и располагаются гроздьями. Поверхность конидий может быть гладкая, шероховатая, шиповатая, бородавчатая, щетинистая и т.д.

Микроскопическое исследование и посев патологического материала при микозах, вызванных диморфными грибами

При этих микозах необходимо учитывать диморфизм возбудителей.

Патологическим материалом при первично патогенных микотических инфекциях (кокцидиоидоз, гистоплазмоз, паракокцидиоидоз, североамериканский бластомикоз), а также хромомикозе, споротрихозе, и мицетомах могут быть гной, мокрота, соскобы с язвенных поражений на коже и слизистой, цереброспинальная жидкость, кровь, биопсированные кусочки из очагов поражения.

Сложность при определении возбудителей этих микозов заключается в том, что из-за их диморфизма при микроскопии патматериала будут обнаруживаться тканевые формы гриба, чаще всего дрожжевые клетки различной морфологии или сферулы с эндоспорами, совершенно непохожие на элементы этого же гриба, извлеченные из его культуры, выросшей при температуре +28 - +30 о С на обычном агаве Сабуро, со значением рН ближе к кислому. Однако нужно иметь в виду, что у некоторых диморфных грибов, можно получить и в культуре дрожжевую фазу роста гриба, часто напоминающую его тканевую форму, но при выращивании на средах, богатых белками со слабо щелочной реакцией (рН = 7,6 - 7,8), при температуре 37 о С.

Вышеуказанное относится к грибам: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis и Sporothrix schenckii.

Лабораторная диагностика микозов, вызванных упомянутыми здесь грибами, основана на обнаружении тканевых форм в патологическом материале при микроскопии, выделении культуры возбудителя и его идентификации по культурально-морфологическим признакам.

Микроскопическое исследование производят в неокрашенных препаратах на предметном стекле в капельке 10% растворе едкой щелочи или смеси спирта с глицерином в равных объемах или в окрашенных мазках (Табл.3).

Посев патологического материала производят на вышеуказанные питательные среды в чашках Петри с помощью бактериологического шпателя по общепринятой методике.

2.5. Микроскопическое исследование и посев патологического материала при дерматомикозах (кератомикозах и дерматофитиях).

Объектом исследования являются поверхностные микозы, поражающие только кератиновый слой эпидермиса, и дерматофиты, поражающие кожу и ее придатки (волосы, ногти), возбудителями которых являются грибы, относящиеся к родам Trichophyton, Microsporum и Epidermophyton.

Лабораторное микологическое исследование включает те же этапы, что и при других микозах: микроскопию материала и получение чистой культуры при его посеве. Правильное взятие материала чрезвычайно влияет на успех микроскопии и получение культуры.

Патологический материал исследуют в ближайшие сроки после взятия. Предварительно его делят на три части: для микроскопии, культивирования и повторного изучения. Микроскопия патологического материала - наиболее простой и быстрый метод для установления наличия гриба в тканях. Размельченный материал помещают на середину предметного стекла в каплю 10-20% раствора КОН и слегка подогревают над пламенем спиртовки до получения белесого ободка по краю капли, накрывают покровным стеклом и оставляют на 5-10 мин (волосы, кожные чешуйки) и 30 - 40 мин (ногтевые) для мацерации и просветления; материал можно обработать и без нагревания, для этого препарат оставляют в 20% растворе КОН на 30-60 мин.

Микроскопируют вначале под малым, затем большим увеличением микроскопа.

Культуральное исследование необходимо для выделения и идентификации возбудителя. Засеваемый материал максимально измельчается и засевается в минимальных количествах на скошенный агар в пробирках в 2-3 точки на расстоянии 1-2 см. Материалом одной пробы засевают не менее 2-3 пробирок (волосы) и 4-5 пробирок (кожные и ногтевые чешуйки). Для первичной изоляции дерматофитов лучше всего использовать стандартную агаризированную среду Сабуро с 2-4% глюкозы или сусло-агар, содержащие антибактериальные антибиотики (пенициллин 50 мкг/мл + стрептомицин 50 мкг/мл или биомицин 200 ед./мл) и антиплесневый антибиотик актидион (циклогексимид) 0,1 - 0,5 мг/мл. Актидион не влияет на рост дерматофитов и подавляет многие плесневые грибы, а также виды Candida и Cryptococcus.

Посевы инкубируют при 22-30 о С (лучше всего 28 о С). Появление роста дерматофитов отмечается с 4 по 12 день инкубации в точках посева по краям внесенного материала. При отсутствии роста в течение 30 дней результаты культивирования считаются отрицательными. В оптимальных условиях первичные культуры многих дерматофитов можно идентифицировать на 7-10 день после посева, но следить за посевами нужно в течение 20-30 дней. Первичные культуры растут сравнительно медленно и при использовании сред без антибиотиков дерматофиты могут быть подавлены более быстро растущими бактериями или плесневыми грибами. При появлении роста в первичном посеве необходимо произвести отсев с края колонии на свежую дифференциальную среду для получения чистой культуры, которая будет служить материалом для идентификации выделенного дерматофита.

2.6. Серологические методы диагностики микозов

Значение серологических методов состоит, главным образом, в следующем: выявление больных с вероятными инвазивными микозами; подтверждение микотической природы аллергических заболеваний; скрининговое обследование групп риска развития микозов.

Ложно положительные результаты серологических проб возможны при миконосительстве и у здоровых людей, сенсибилизированных антигенами грибов, отрицательные пробы могут быть при иммунодефиците даже на фоне протекающего инвазивного микоза.

Рутинные общепринятые методы серологической диагностики микозов
достаточно подробно описаны /П.Н.Кашкин, В.В.Лисин. "Практическое
руководство по медицинской микологии", Медицина, 1983/. Однако в последние
десятилетия произошли заметные сдвиги в методических подходах /Елинов Н.П.,
2001/. Предложены оригинальные процедуры обнаружения антигенов и антител
некоторых метаболитов клеток грибов; созданы специальные диагностические
наборы (“киты”), например Pastorex ® Candida, для определения в
реакции "латекс-агглютинации" повторяющихся олигоманнозных эпитопов антигенных
структур/, экспрессирующихся на большом числе макромолекул
гриба; для определения антигена-маннана Candida, например, в
сыворотке крови пациента с кандидемией, можно воспользоваться набором Platelia ® Candida.
С помощью первого набора порог определения антигенных структур равен 2,5 нг/мл, с помощью второго в связке с _____________методом порог определения - 0,5 нг/мл.

Возбудители микозов, наиболее часто выявляемые при лабораторном исследовании различных клинических материалов

Кровь

Candida
Cryptococcus
Мицелиальные возбудители редко выявляются при исследовании крови за исключением Fusarium

Спинномозговая жидкость

Candida
Cryptococcus

Гной, отделяемое из абсцессов, язв и пр.

Candida
Cryptococcus
Fusarium
Aspergillus
Sporotrix

Респираторные секреты (мокрота, БАЛ, бронхиальная браш-биопсия, транстрахеальный аспират)

Aspergillus
Candida
Cryptococcus
Mucor
Scedosporium
Rhizopus
Sporotrix

Отделяемое, биопсийный материал из ран

Aspergillus
Candida
Fusarium
Rhizopus

Прочие биосубстраты

Candida
Cryptococcus

Материал из грудной,брюшной полости; синовиальная жидкость

Aspergillus
Candida
Fusarium

Стекловидное тело

Candida
Aspergillus

IV. Критерии диагностики системных микозов: клинические и лабораторные параметры окончательного диагноза

Эзофагит

наличие характерных изменений при эзофагоскопии
выявление гриба при культивировании биопсийного материала
наличие псевдомицелия в окрашенных мазках или признаков инвазивного роста грибов в биопсийном материале

Пневмония

Пневмония, обусловленная Candida spp.

остро возникшие инфильтративные изменения на рентгенограмме легких, совпадающих с клиническими проявлениями грибковой пневмонии
выявление Candida spp. При культивировании материала из нижних отделов респираторного трата, полученного при трансторакальной биопсии, трансбронхиальной биопсии, открытий биопсии легкого или торокоскопически направленной биопсии
выявление псевдомицелия в адекватно окрашенном биопсийном материале

Пневмония, обусловленная Aspergillus spp., Fusarium spp., Scedosporium apiospermum

выявление элементов грибов в тканях и положительная культура
персестирующие или прогрессирующие инфильтраты в легких, резистентные к антибактериальной терапии
выявление одного из указанных возбудителей при культивировании мокроты или БАЛ
клинические признаки пневмонии (кашель, одышка, “плевральные” боли, хрипы, шум трения плевры)
характерные изменения при рентгенографии или КТ легких:

Субплевральные инфильтративные, узелковые, остроугольные или кавернозные изменения

Симптом “ореола” при КТ легких

Прогрессирование инфильтративных изменений с образованием полостей и появлением симптома “серпа”

отсутствие других возбудителей при культивировании БАЛ, которые могли бы вызвать представленные изменения легких

Синусит

клинические и рентгенологические признаки острого синусита
микроскопические и культуралъные признаки микоза при исследовании аспирата или биопсийного материала

Инфекция мочевыводящих путей

выявление >1х10 кое/мл при повторных посевах правильно собранной мочи

Фунгемия

Однократное выявление грибов при посеве крови в период подъема температуры тела > 38 о С

Острый диссеминированный микоз

Фунгемия в сочетании с культуральными или гистологическими признаками поражения глубоких тканей (включая подкожную клетчатку) или выявление возбудителя из двух в норме стерильных биосубстратов

Эндофтальмит

офтальмологические признаки эндофтальмита
выявление возбудителя из глаза, крови или других очагов диссеминации

Абсцесс или остеомиелит

рентгенографические/КТ/МРТ признаки остеомиелита
выявление возбудителя в аспирате или биопсийном материале

Менингит

определение изменений СМЖ, подтверждающих наличие воспаления, и выявление грибов при микроскопии СМЖ
выявление грибов при посеве СМЖ или определение антигенов Cr.neoformans, Candida и Aspergillus в СМЖ

Хронический диссеминированный (гепатолиенальный) кандидоз

Возможный

персистирующая или интермиттирующая лихорадка после завершения периода нейтропении в сочетании с характерными признаками поражения печени, селезенки или почек

Доказанный

вышеуказанное в сочетании с высевом Candida spp. из крови до появления признаков поражения печени, селезенки или почек или с культуральными, гистологическими признаками кандидоза в биопсийном материале из очагов

V. ВОЗБУДИТЕЛИ ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЙ

Существуют различные принципы классифицирования грибковых инфекций и их возбудителей. Нам представляется практически наиболее простым и целесообразным разделить патогенные грибы на 5 основных групп:

1. Возбудители поверхностных микозов;

2. Возбудители дерматомикозов;

3. Возбудители подкожных микозов;

4. Возбудители глубоких микозов (первично-патогенные микромицеты, возбудители оппортунистических инфекций).

5. Возбудители псевдомикозов.

* Следует подчеркнуть, что возбудители первых трех групп у иммуносупрессированных пациентов могут быть причиной фунгемии и полиорганных поражений.

Описание возбудителей микозов в последующих разделах мы даем по единой схеме: его наименование по принятой номенклатуре, перечень синонимов, макроскопическую характеристику колоний на питательных средах и микроскопическую характеристику элементов гриба, видимых под микроскопом в нативных препаратах и из колоний. Приводятся также данные о распространении грибов в природе и перечисляются вызываемые ими заболевания.

Основными в этиологической лабораторной диагностике микозов до настоящего времени продолжают оставаться классические методы, включающие микроскопию материала, выделение чистой культуры возбудителя с последующей его идентификацией. Иммунологические методы диагностики имеют вспомогательное значение. Они используются для выявления наиболее значимых возбудителей: патогенных диморфных грибов, а также возбудителей криптококкоза, кандидоза и аспергиллеза. Методы геноиндикации (полимеразная цепная реакция) также имеют ограниченное применение ввиду их недостаточной специфичности, но применяются преимущественно при диагностике глубоких и оппортунистических микозов.

Материалом для исследования при лабораторной диагностике микозов в зависимости от формы заболевания могут быть: кожа и ее придатки (волосы, ногти), отделяемое ран и свищей, мокрота, кровь, ликвор и моча, тканевые биоптаты. Правильностью взятия патологического материала во многом определяется эффективность дальнейшего лабораторного исследования. При кожных поражениях материал отбирается чаще всего методом соскобов или с использованием липкой ленты (преимущественно при поверхностных формах) до лечения из свежих, но полностью развившихся очагов по периферии, где находятся наиболее жизнеспособные возбудители.

При выявлении грибов-дерматофитов чрезвычайно информативным материалом являются волосы, поскольку характер поражения волос позволяет идентифицировать возбудителя. Определению очага поражения в ряде случаев помогает использование лампы Вуда. Пораженные волосы вместе с чешуйками извлекаются эпиляционным пинцетом. При хронической черноточечной трихофитии волосы извлекают из кожи препарировальной иглой.

Ногти отбирают на протяжении всех слоев, срезая острым скальпелем или ножницами. Более эффективен отбор с использованием зубного бура. При кандидозных поражениях материал отбирается с помощью соскоба с ногтевого валика. Отобранный материал доставляется в лабораторию в пакетах из темной бумаги, чтобы избежать высыхания и контаминации посторонней микрофлорой. Материал, содержащий гной, доставляется в стерильных бакпечатках или чашках Петри. Мокрота отбирается в стерильную посуду. Исследование мокроты должно быть проведено не позднее 2 ч после сбора. При удлинении сроков исследования образцы должны храниться в холодильнике при + 4 °С, в противном случае могут возникнуть диагностические ошибки, связанные с появлением псевдомицелиальных форм дрожжевых клеток.

Кровь и спинномозговая жидкость отбираются с соблюдением правил асептики. Посев крови осуществляется в жидкую среду Сабу- ро. Для исключения контаминации образцов крови проводят их повторные исследования. Спинномозговую жидкость центрифугируют, а осадок используют для микроскопирования и посева.

Моча отбирается утром в стерильную посуду, при этом необходимо избегать загрязнения материала микрофлорой кожи промежности. Посев мочи осуществляется с использованием количественных методов посева.

В диагностике микозов используются препараты как из нативного материала, так и окрашенные. При исследовании неокрашенных препаратов плотный материал предварительно просветляют (мацери- руют) 10-30% раствором КОН (можно использовать растворы диметил сульфоксида), а затем микроскопируют по методу «раздавленной капли». Для придания контрастности препараты прокрашивают водным раствором метиленового синего.

Окраску фиксированных мазков осуществляют различными способами: по Граму, метиленовым синим, по Романовскому - Гим- зе. Последний способ позволяет увидеть мелкие дрожжевые клетки и стадии фагоцитоза. Для криптококков используют окраску тушью, окраску с муцикармином по Саутгейту. Меланинсодержащие грибы (темноокрашенные), например Cladophialophora bandana , окрашивают по Массой - Фонтана (окраска меланина, входящего в состав клеточной стенки). Флюоресцирующие сыворотки используются при диагностике возбудителей глубоких микозов, возбудителей дерматофи- тии, грибов рода Candida.

Выделение чистой культуры возбудителя дает возможность установить родовую и видовую принадлежность гриба, изучить его свойства и чувствительность к антимикробным препаратам. Для выделения и идентификации грибов используют плотные и жидкие питательные среды Сабуро, сусло-агар. Эти среды обеспечивают рост большинства патогенных и условно-патогенных грибов. Кроме того среда Сабуро (рис. 8.2) стимулирует процессы пигментообразования у грибов, что имеет значение при идентификации.

Для подавления роста бактерий-контаминантов в среды добавляют антибиотики: левомицетин, стрептомицин, пенициллин, тетрациклин. Для выделения прихотливых патогенных грибов используют среды, обогащенные кровью и сердечно-мозговым экстрактом. Специальные среды используют для культивирования и идентификации грибов: среда Чапека - для формирования конидий при идентификации плесневых грибов, картофельный (картофельно-морковный) агар, рисовый агар - для выявления типов роста и получения хламидоспор при идентификации грибов рода Candida , морковный (овощной) агар - для получения типичных колоний культуры гриба Trichophyton schonleini, среда Кашкина - для выделения пигментообразующих грибов. Используются и дифференциально-диагностические среды, например, для идентификации С. albicans - хромогенные среды или среды, позволяющая определить фосфолипазную активность гриба.

Время инкубации грибов составляет от нескольких суток до 1 месяца и более. При подозрении на патогенные диморфные грибы для выдачи отрицательного ответа культивирование проводится в течение 8 недель.

Посевы проводят на среды, разлитые по пробиркам, флаконам и чашкам Петри. Посевы материала на грибы-дерматофиты осуществляют одновременно на несколько пробирок со средой. Материалы, подозрительные на содержание плесневых грибов (мокрота), засевают в 3 точки и инкубируют при 28 и 37 °С. Для решения вопроса об отсутствии контаминации при заборе материала осуществляют контрольные посевы воздуха на содержание плесневых грибов в помещениях лаборатории и палатах, где находятся больные.

При культивировании грибов в микологической лаборатории соблюдаются меры безопасности, аналогичные таковым в бактериологических лабораториях. Работу с плесневыми грибами и микотоксинами во избежание аллергизации персонал проводит в боксированных помещениях в марлевых повязках или в настольных боксах с вытяжкой. Работа с культурами, относящимися ко II группе патогенности (патогенные диморфные грибы), возможна только в специализированных лабораториях.

Идентификация видов грибов проводится на основании комплекса культуральных, морфологических и других признаков. К первым относятся морфология колонии, ее окраска и размеры при культивировании на специальных средах, строение края и центра, характер поверхности, наличие и характер репродуктивных органов, ко вторым - особенности микроскопического строения мицелия, строение, форма и размеры репродуктивных органов - конидиеносцев, конидий, хламидоспор, артроспор и т.д.

Грибы формируют различные типы колоний на плотных питательных средах. Ученые из института Г. Вентера (США), учитывая способность грибов выделять в среду пигментные вещества, создали в питательной среде «новогоднюю елку» (рис. 8.3).

Рис. 8.3. «Новогодняя елка» из грибов (верхушка: Talaromyces stipitatus ; дерево Aspergillus nidulans; украшения: Penicillium marneffei; пенек: Aspergillus terreus)

Ферментативные и ассимиляционные способности культур имеют большое значение при идентификации дрожжей (дрожжеподобных грибов). В настоящее время для идентификации часто встречающихся грибов - возбудителей заболеваний человека и животных - применяются коммерческие тест-системы: BBL Mycotube, API 20С bio Merieux и др.

Для исследования можно брать чешуйки, пораженные волосы, покрышки пузырьков, гной из открытых очагов поражения, ногтевые пластинки, мокроту, кал, мочу, рвотные массы, желчь, тканевую жидкость. От правильного взятия материала во многом зависит успех микроскопического исследования при дерматомикозах. Элементов гриба бывает обычно больше на свежих нелеченных, но уже сформированных участках поражения. При микозах гладкой кожи для исследования берут чешуйки периферических участков очага путем соскабливания скальпелем. У больных дисгидрозом стоп, кистей ножницами или лезвием безопасной бритвы срезают покрышки пузырьков или бахромки отслоенного эпителия. При дерматомикозах с поражением длинных и пушистых волос материал берут эпиляционным пинцетом, иногда - острием скальпеля, если волосы обломаны на уровне кожи. При инфильтративно-нагноительных процессах в периферии очага отбирают волосы, которые плавают в гное. Гной берут фолькмановской ложечкой и переносят в чашку Петри или на часовое стекло. Препаровочной иглой вылавливают пораженные волосы и размещают на предметное стекло. Таким же образом собирают гной из открытых очагов поражения, свищей, а из закрытых - путем пункции шприцом.

Соскобы с пораженной слизистой оболочки берут стерильным шпателем, петлей, ножницами, маникюрными щипцами, а из более глубоких слоев - бормашиной.

При глубоких микозах для исследования берут мокроту, желчь, мочу, тканевую жидкость и вносят в стерильные стеклянные банки с притертой пробкой. Иногда используют биопсию кусочков ткани, внося их в стерильные чашки Петри или стеклянные банки. Взятый материал пересылают в лабораторию вместе с сопроводительным направлением, где указывают фамилию, имя и отчество больного, возраст, предварительный диагноз, локализацию поражения, характер и дату взятия материала.

Наряду с этим, в препарате имеются негрибковые элементы: пузырьки воздуха, капельки жира.

Для диагностики глубокого микоза, чаще всего, готовят и исследуют окрашенные препараты, используя в качестве материала гной, выделения свищей, язв, соскобов грануляций и т.д. Материал наносят тонким слоем на предметное стекло, грануляционную ткань предварительно расщепляют препаровочной иглой. Приготовленные мазки фиксируют смесью Никифорова, 5-процентным водным раствором хромовой кислоты или смесью Кармует (10 г ледяной уксусной кислоты, 60 мл этилового спирта и 30 мл хлороформа), потом сушат и красят.

Окраска зависит от цели исследования. Чаще всего красят по Граму, Граму- Вельшу, Циль-Нильсену, Романовскому-Гимзе, Сабуро, Адамсону и др.

Многообразие клинических проявлений наиболее распространенных дерматомикозов (трихофития, микроспория, эпидермофития, руброфития), их различия в связи с локализацией процесса (волосистая часть головы, гладкая кожа, складки, ногти) усложняют диагностику. Поэтому в ряде случаев необходимо культуральное подтверждение диагноза. Правильное установление диагноза облегчает лечение, а главное - позволяет целенаправленно проводить эпидемиологические и профилактические мероприятия.

По данным ученых, симптомы микоза стоп имеются у 70% населения Земли. При этом заболевании страдают межпальцевые складки и кожа на подошвах. Причиной болезни является грибок, который вначале встречался лишь в ограниченных районах юго-востока Азии и в Африке. Первая мировая война, вызвав массовую миграцию населения и ухудшение санитарных условий, привела к распространению болезни по всему миру.

Что провоцирует микоз стоп

Основной возбудитель болезни - Trichophyton rubrum. Поражение могут вызвать T. mentagrophytes и Epidermophyton floccosum. Значительно реже патогенными микробами могут стать грибки рода Candida и плесневые микроорганизмы.

Наиболее значимые факторы риска заболевания:

сахарный диабет;
иммунодефицитное состояние (СПИД);
плоскостопие;
атеросклероз периферических артерий;
варикозная болезнь вен нижних конечностей.

Внешние условия, способствующие развитию инфекции:

закрытая негигроскопичная обувь;
травмы стопы (мозоли, потертости);
занятия спортом.

Симптомы микоза стопы чаще всего бывают у взрослых мужчин. Дети болеют редко.

Симптомы микоза стоп

При развитии заболевания появляется шелушение и сухость кожи, зуд и жжение, особенно в межпальцевых промежутках, появление болезненных трещин под пальцами. Иногда первые симптомы микоза стопы – пузырьки, лопающиеся с образованием эрозий. Часто болезнь протекает в стертой форме, проявляясь лишь небольшим шелушением, напоминающим муку, в складках между пальцами.

Существует 4 клинических формы заболевания.

Межпальцевой, или интертригинозный вариант, - самый частый. Кожа между пальцами краснеет, трескается, поверхностный слой мокнет и шелушится. Эти признаки распространяются на подошву, сопровождаются сильным зудом и жжением. Нередко присоединяется бактериальное воспаление.

Сквамозно-гиперкератотический вариант связан с выраженным утолщением и растрескиванием кожи. Подошва краснеет и шелушится. В области пяток появляются глубокие болезненные трещины, зуд обычно нехарактерен. Часто это двустороннее поражение, его еще называют «мокасиновой стопой».

Дисгидротический вариант сопровождается возникновением множественных мелких зудящих болезненных пузырьков. Они сливаются друг с другом, образуя крупные пузыри. Покрышки пузырей лопаются, обнажая блестящую ранимую болезненную поверхность – эрозию. Внешние проявления напоминают экзему.

Нередко присоединяется микробное воспаление с увеличением паховых лимфоузлов, лихорадкой, болью в ноге, тошнотой, головной болью и другими признаками интоксикации. При дисгидротическом виде часто возникает аллергия на грибки – микотическая экзема. Она сопровождается высыпаниями на участках тела, не зараженных грибком, например, на кистях.

Стертый вариант обычно протекает незаметно. Он сопровождается небольшим шелушением кожи между большим и указательным и/или безымянным и мизинцем на ноге. Зуд отсутствует.

Признаки микоза стоп

Разные виды микоза стоп могут быть самостоятельными заболеваниями или протекать как часть общего грибкового поражения организма. Иногда возникает признак «две стопы – одна кисть» с вовлечением этих органов. Может присоединяться онихомикоз – грибковое разрушение ногтя. Иногда одновременно страдают паховые складки.

Основные симптомы и лечение микоза стопы представлены на фото:

Шелушение кожи

Сухость и растрескивание кожи

Пузырьки и эрозии

Диагностика

Распознать различные виды микоза стоп опытный врач-дерматолог может во время первого осмотра. Однако для подтверждения диагноза необходимо микроскопическое исследование. Для него используют чешуйки из очага поражения, соскребенные с помощью шпателя и обработанные раствором щелочи. Полученный материал рассматривают под микроскопом и обнаруживают возбудителей.

Метод прямой микроскопии быстрый, дешевый и простой в выполнении, но не позволяет определить, какой вид грибка вызвал заболевание. Поэтому проводится посев материала на питательную среду с последующим культуральным исследованием полученного материала. Однако получить культуру грибка после обнаружения его под микроскопом удается лишь в 20 – 6о% случаев.

Виды лечения микоза стоп

Препараты для терапии грибковых заболеваний должен назначить врач-дерматолог. Обычно лечение микоза стопы проводят с помощью наружных средств.

Один из эффективных препаратов при этом заболевании – клотримазол. В нашем магазине вы можете купить его по невысокой стоимости. Лекарственное средство в форме лосьона Клотримазол для ногтей и кожи подавляет размножение грибков в толще рогового слоя эпителия. При поражении межпальцевых складок лосьон наносят ежедневно на чистую сухую кожу стоп в течение недели, при необходимости дольше.

При выраженном ороговении и растрескивании кожи вначале необходимо устранить омертвевшие кожные наложения. Для этого необходимо использование отшелушивающих медикаментов. Например, назначают салициловую мазь, кремы с молочной кислотой или мочевиной. После удаления роговых отложений лосьон применяют 1 – 2 раза в день.

При дисгидротическом варианте на первом этапе нужно уменьшить мокнутие. Для этого используются примочки с танином или борной кислотой. В тяжелых случаях к лечению добавляют глюкокортикоидные средства. Затем применяют лосьон Клотримазол по обычной схеме.

При стертой форме стопы обрабатывают лосьоном 1 раз в день в течение 7 – 10 дней, но длительность курса индивидуальна и определяется врачом.

Системная терапия

При длительном или рецидивирующем микозе стоп может потребоваться прием противогрибковых препаратов внутрь. Они попадают из желудочно-кишечного тракта в кровоток, а затем в кожу, где уничтожают грибки. Используются три основных препарата:

флуконазол;
итраконазол;
тербинафин.

Длительность приема этих средств составляет не менее месяца. Их цена довольно высока. Поэтому предупредить микоз стопы всегда проще и выгоднее, чем его вылечить.

Системные препараты особенно часто назначаются, если грибок поразил не только кожу, но и ногти. В этом случае лекарства накапливаются в отрастающей части ногтевой пластинки, и постепенно отрастает здоровый ноготь. Для улучшения эффекта ноготь могут полностью удалить хирургическим путем, после чего он восстанавливается уже без грибка.

Сочетание удаления ногтя, системной и местной противогрибковой терапии особенно часто бывает необходимо у пожилых пациентов. В этой группе пациентов нередко ногти растут медленно, кровообращение в стопах нарушено, поэтому для достижения эффекта требуется большая доза препаратов и длительный курс лечения.

Лечение народными средствами

Применение только рецептов народной медицины не поможет избавиться от грибка. Однако такое дополнение к обычной терапии сокращает курс лечения и ускоряет выздоровление.

Полезно каждый вечер делать теплые ванночки для ног в течение 10 минут, после чего тщательно промокнуть стопы полотенцем, особенно между пальцами, и нанести лечебный лосьон Клотримазол для ногтей и кожи. Полезные компоненты для ванн, снимающие воспаление и уменьшающие зуд:

трава чистотела и зверобоя;
корни лопуха;
трава полыни;
листья эвкалипта;
хвоя пихты;
свежая гуща от сваренного молотого кофе;
поваренная соль;
смесь из натертого хозяйственного мыла, пищевой соды, марганцовки и горчичного порошка.

Пораженные места можно смазывать березовым дегтем или самостоятельно приготовленной мази из 100 граммов сливочного масла в смеси с растертой головкой чеснока. Полезен и прополис, который можно прибинтовывать к больным ногтям.

Полезно делать компрессы из натуральных средств. Сначала их оставляют на 1 – 2 часа, а при хорошей переносимости – на ночь. Используют такие ингредиенты:

мякоть тыквы;
измельченные семена черной редьки;
перечная мята, растертая с солью;
листья лопуха или рябины, слегка размягченные с помощью скалки.

Эффективно смазывание пораженных мест соками некоторых растений и других натуральных средств:

спиртовый раствор прополиса;
луковый или чесночный сок;
сок чистотела;
масло чайного дерева.

Профилактика заболевания

Для того чтобы избежать микоза или предотвратить его рецидив, нужна простая, но постоянная профилактика:

летом носить воздухопроницаемую обувь из натурального материала;
при посещении бассейнов, бань, общественных душевых надевать индивидуальные резиновые тапочки;
не надевать чужую обувь, например, в гостях;
использовать только собственные приборы гигиены – ножницы, пемзу, пилку для ногтей.

Чтобы избежать повторного заражения, стельки и внутреннюю поверхность обуви нужно регулярно обрабатывать дезинфицирующими средствами. Известный народный рецепт – раствор уксусной эссенции, однако он имеет резкий неприятный запах.

Врачи рекомендуют применять препарат Микоспрей, обладающий не только противогрибковым, но и антибактериальным действием. Микоспрей отлично подходит не только для обработки обуви, но и для нанесения на ноги перед посещением общественных мест для защиты стоп.

Приобрести препараты для лечения микоза стопы и для его профилактики жители Москвы и регионов могут в нашем интернет-магазине. Они имеют доказанную эффективность и безопасность. Их использование рекомендуется всем людям, которые не хотят заразиться грибком стопы или быстро избавиться от него.